德宏州油茶炭疽病拮抗內生芽孢桿菌6715的篩選與鑒定*

周嬡婷，王芳，尹加筆 ，劉麗，張東華，洪英娣，沈德周，馬煥成，伍建榕,

(1.西南林業大學生物多樣性保護學院，云南省高校森林災害預警控制重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業大學林學院，國家林業和草原局西南地區生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；3.德宏州林業和草原局，云南 德宏 678400)

油茶(Camelliaoleifera)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)[1]，是一種經濟樹種，不僅能榨取高質量的食用油，而且具有一定的生態價值[2]。近年來由于炭疽病的流行，導致油茶嚴重落花、落果、甚至整株植株死亡[3]，造成油茶產量和產品質量急劇下降。對此，化學防治是主要防治措施，進而導致農藥殘留、病原菌產生抗性、污染環境等，而生物防治因綠色、安全、高效的特點逐漸成為了化學防治的有效替代措施。所以，本文針對油茶炭疽病開展生物防治研究。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是目前研究最廣泛的生物防治劑，已被廣泛用于開發生物農藥和殺真菌劑，主要是由于其次級抗微生物代謝產物在植物病害中發揮重要保護作用，其中脂肽類物質就是其中之一[4]，該類物質因具有理想特性而備受關注，如廣譜性、低毒性、抗微生物活性強等[5]。Zhu M等[6]發現菌株F85貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)和T113淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)對根腫病害具有顯著的抑制作用。信珊珊等[7]從水稻(Oryzasativa)根部分離到一株解淀粉芽孢桿菌，進一步研究發現其發酵液中的脂肽類物質引起油茶炭疽病菌絲畸形而產生抑制作用。本研究擬對油茶健康葉片中分離的內生細菌進行鑒定，后通過平板對峙法篩選對油茶炭疽菌具有高效抑菌活性的拮抗細菌，并初步探討高效拮抗細菌的抑菌機制，為油茶炭疽病的綠色防治及新型生物農藥的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原真菌

炭疽菌(Colletotrichumfructicola)于德宏州油茶基地感病葉片中分離得到，該菌株保存于西南林業大學生物多樣性保護與利用學院病理學實驗室。

1.1.2 供試培養基

PDA培養基 1 L的培養基含200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

LB培養基 1 L的培養基含10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L Nacl，15～20 g瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 內生細菌的分離

從德宏州油茶基地采集健康葉片和果實，參考方中達[8]的方法，分離內生細菌。材料均用自來水沖洗1 min，以去除表面雜質，后放入75%乙醇溶液中浸泡消毒2～3 s，接著用無菌水清洗3遍，以除去殘余的乙醇溶液，最后用無菌刀片切下健康組織5 mm×5 mm的小塊，將其轉移至LB固體培養基中，置于28 ℃培養箱培養48 h，用劃線法純化菌株[9]，4 ℃斜面保存。

1.2.2 內生細菌16S rRNA序列分析

參照生工細菌試劑盒說明書進行DNA提取，然后利用細菌通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)[10]擴增16S rRNA片段，擴增的PCR產物送碩擎生物技術有限公司測序，所得序列在Etaxon網站(網址https://www.ezbiocloud.net/identify)比對分析。

PCR反應體系(50 μL)：25 μL Mix，20 μL ddH2O，1 μL 27F，1 μL 1492R，3 μL DNA模板。PCR反應條件：95 ℃變性5 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，33個循環；72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。

1.2.3 內生細菌的體外抑菌效果篩選

采用平板對峙法[11]篩選拮抗菌株。炭疽菌于PDA培養基培養7 d，制成直徑6 mm的菌塊，然后移至新的PDA培養皿中央。用待測菌株菌懸液(每片濾紙片打5 μL，OD600=0.1)點接至距離培養皿中央3 cm的4個位置處，無菌水處理作對照，每處理3次重復，置于26 ℃培養箱培養，第4 d起每天記錄病原菌直徑，計算抑菌率[10]，抑菌率公式如下所示。

抑菌率=[(未處理病原菌直徑-處理病原菌直徑)/未處理病原菌直徑]×100%

1.2.4 抑菌效果最佳菌株在油茶離體葉片上對炭疽菌的抑制效果

經體外平板對峙培養法篩選25株內生細菌對炭疽菌的抑制效果后，選擇抑菌率最高的1株內生細菌進行葉片回接。回接共設4個處理：(1)無菌水(對照)；(2)菌懸液；(3)炭疽菌；(4)菌懸液+炭疽菌，每處理3次重復。回接后葉片質量標準參照表1。

表1 油茶葉片質量分級標準

用無菌針刺傷葉片中央，菌懸液培養24 h后，均勻噴施于葉片表面，再過24 h后在刺傷位置接種直徑5 mm的病原菌塊，第4 d起每天觀察記錄，計算病情指數和發病率[12]，公式如下所示。

病情指數=[(各病級葉片數×該級代表數值)/(總葉片數×最高一級代表數值)]×100

發病率=(發病葉片總數/葉片總數)×100%

1.2.5 抑菌效果最佳菌株的鑒定

形態學鑒定 把單菌落轉移至液體培養基，置搖床上28 ℃，180 r/min培養24 h。菌懸液搖勻后，取1 mL于1.5 mL離心管中，加入9 mL無菌水，用梯度稀釋法制備1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8的稀釋液。取100 μL 稀釋液涂布于LB固體培養基中，置于28 ℃培養箱培養24 h，觀察菌落形態特征[13]。

16S rRNA基因系統發育分析 抑菌效果最佳菌株擴增后的PCR產物送至碩擎生物技術有限公司測序，測得的序列在Etaxon網站中(網址https://www.ezbiocloud.net/identify)進行比對，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構建系統發育樹，確定該菌株的系統發育學地位。

1.2.6 抑菌效果最佳菌株脂肽基因檢測

根據Farzand等[14]報道：Iturin、Bacillomycin、Fengycin、Bacillaene、Plipastatin、Bacillibactin、Surfacin和Bacylisin等脂肽類物質具有高效的抗真菌活性。本文以效果最佳菌株的DNA為模板，擴增該菌株相應脂肽基因，各脂肽基因特異性引物見表2。

表2 各脂肽基因引物信息

PCR反應體系(50 μL)：25 μL Mix，18 μL ddH2O，引物各2 μL，3 μL DNA模板。PCR反應條件：95 ℃變性3 min，94 ℃變性30 s，具體退火溫度見表2，退火時間40 s，72 ℃延伸40 s，32個循環，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3 數據處理

數據處理及圖表制作采用Excel 2010軟件，數據顯著性分析采用SPSS Statistics 17.0進行單因素ANOVA Duncan’s多重差異顯著性分析，差異水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離與16S rRNA序列分析

本研究共獲得25株內生細菌，均來自健康葉片，所得菌株經16S rRNA序列分析鑒定，結果見表3。

表3 25株內生細菌16S rRNA序列比對結果

表3顯示：25株內生細菌其中88%的菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。其中菌株6701、6703、6705、6707、6708、6709、6712、6714、6715、6718、6719、6720和6725的近源菌為B.tequilensisKCTC 13622，其序列相似性在99.58%～99.93%之間，占總分離菌株數的52%。菌株6702與近源菌B.megateriumNBRC 15308的相似性為99.59%，占總分離菌株數的4%。菌株6704與B.mobilis0711P9-1相似性最高，其相似性為99.1%，占總分離菌株數的4%。菌株6706與B.velezensisCR-502相似性最高，其相似性為99.21%，占總分離菌株數的4%。菌株6710與B.proteolyticusTD42相似性最高，相似性為99.59%，占總分離菌株數的4%。菌株6711和6717與近源菌B.halotoleransATCC 25096相似性最高，序列相似性為99.3%，占總分離菌株數的8%。菌株6713與S.sciuriDSM 20345相似性最高，其相似性為99.86%，占總分離菌株數的4%。菌株6716與近源菌B.siamensisKCTC 13613相似性為99.37%，占總分離菌株數的4%。菌株6721與L.adecarboxylataNBRC 102595相似性最高，相似性為99.71%，占總分離菌株數的4%。菌株6722和6723與近源菌B.zanthoxyli1433相似性最高，序列相似性在99.58%～99.65%之間，占總分離菌株數的8%。菌株6724與P.intestiniLAH16相似性最高，相似性為99.23%，占總分離菌株數的4%。

2.2 25株內生細菌的體外抑菌效果篩選

以油茶炭疽菌為指示菌，分離得到的25株內生細菌為待測菌株，用平板對峙法測定各待測菌株的抑菌效果，結果見圖1和圖2。由圖1可見，菌株6715的抑菌效果最好。

圖1 25株內生細菌對油茶炭疽菌的體外抑菌作用注：開展對峙培養實驗的第7 d效果。Fig.1 Antagonistic activity of 25 strains isolated from healthyC.oleifera leaf against Colletotrichum fructicola in vitro

圖2 25株內生細菌對油茶炭疽菌的抑菌率注：第7 d 25株內生細菌對油茶炭疽菌的抑菌率結果；不同字母經單因素ANOVA Duncan’s多重差異顯著性分析，差異水平為P<0.05。Fig.2 The inhibitory rate of 25 endophytic bacteriastrains against Colletotrichum fructicola

圖2可見菌株6715抑菌率最高(57.59%)，顯著高于其他待測菌株，占比為4%。菌株6703、6705、6706、6707、6708、6709、6711、6712、6714、6718、6719、6720和6725共13株內生細菌抑菌率在40%～50%之間，占25株菌株總數的52%，且不同菌株間抑菌率差異不顯著。菌株6701和6717抑菌率在30%～40%之間，占比為8%。菌株6716抑菌率在20%～30%之間，占比為4%。菌株6704、6723和6724抑菌率在10%～20%之間，占比為12%。菌株6702和6713抑菌率在0～10%之間，占比為8%。菌株6710、6721和6722抑菌率在-10%～0%之間，占比為12%。

2.3 抑菌效果最好菌株6715在離體油茶葉片上對炭疽菌的抑制效果

經體外平板對峙培養法篩選出菌株6715對該病原真菌的抑制效果最佳，對其進行葉片回接，各處理回接第10 d的結果見圖3、表4和圖4。

圖3 菌株6715在離體葉片上對油茶炭疽菌的抑制效果注：為葉片回接第10 d的效果，處理1、處理2、處理3、處理4分別表示無菌水(對照)(1-1，1-2，1-3)、菌懸液6715(2-1，2-2，2-3)、油茶炭疽菌(3-1，3-2，3-3)、菌懸液+油茶炭疽菌(4-1，4-2，4-3)。Fig.3 Inhibitory effects of strain 6715 againstColletotrichum fructicola on detached leaves ofC.oleifera after inoculation 10 days

表4 離體葉片病斑直徑及發病率

圖4 第10 d病斑直徑注：葉片回接第10 d數據，不同字母經單因素ANOVA Duncan’s多重差異顯著性分析，差異水平為P<0.05。Fig.4 Effects of strain 6715 on lesion diameterafter inoculation 10 days

圖3和表4可以明顯的看出，處理1(無菌水，對照)和處理2(菌懸液6715)在整個時段內回接的葉片均未發病，且葉片顏色均為亮綠色，說明內生菌株6715為非致病菌。回接第7 d時，處理3(油茶炭疽菌)，葉片均出現病斑，病斑較小，葉片顏色逐漸褪去，其發病率為100%，病情指數為25。同時，處理4(菌懸液6715+油茶炭疽菌)部分葉片出現病斑，不明顯，較為輕微，葉片顏色基本未發生變化，其發病率為44.44%，病情指數為11，顯著低于處理3(油茶炭疽菌)。回接第10 d時，處理3(油茶炭疽菌)，葉片病斑明顯增大，病斑直徑為5.36 mm，顯著高于處理4(菌懸液6715+油茶炭疽菌)(圖4)，葉片顏色由亮綠色褪為黃綠色，病情指數達50，增加為第7 d處理的2倍。同時，處理4(菌懸液6715+油茶炭疽菌)葉片均出現病斑，病斑較小，直徑為1.84 mm，較為輕微，顯著低于處理3，葉片顏色微微褪綠，變化不大，病情指數增大到25。以上結果表明，內生菌株6715為非致病菌，且對油茶炭疽菌有較好的抑制活性。

2.4 抑菌效果最好菌株6715的鑒定

2.4.1 形態學

菌株6715的液體培養單菌落，于搖床28 ℃、180 r/min過夜培養。取100 μL 1×10-6的稀釋液涂布，恒溫箱28 ℃培養24 h后進行革蘭氏染色，結果見圖5。

圖5 菌株6715形態特征

菌株6715培養基上菌落呈乳白色，近圓形，菌體干燥、無粘性，表面粗糙，菌落中央有皺褶產生。革蘭氏染色結果表明，該菌株為陽性菌，呈棒桿狀。

2.4.2 16S rRNA基因系統發育聚類圖

通過對菌株6715的16S rRNA基因發育系統(圖6)的分析，發現與其相似性最高的菌株為SJ33(MG396987)，序列相似性為100%，且與B.tequilensis種的菌株聚為一支，所以，將菌株6715鑒定為B.tequilensis。

2.5 菌株6715脂肽基因檢測

由圖7可以看出，通過對菌株6715脂肽基因進行檢測發現，該菌株存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)，但是脂肽基因fenD、baC、baE、bmyB、ituB均未檢測到，其中檢測到的基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分別與Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種脂肽物質相對應。

圖6 菌株6715 16S rRNA基因系統發育分析

圖7 菌株6715脂肽基因擴增結果注：M表示Marker，1，2，3，4，5，6，7，8分別是基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)、srfAA(200 bp)、fenD、baC、baE、bmyB、ituB，其中基因4，5，6，7，8未檢測到。Fig.7 Electrophoresis of biosynthesis genes for strain 6715

3 討論與結論

3.1 討論

本次研究從健康葉片共獲得25株內生細菌，經分子鑒定表明：有88%的菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。其中13株與近源菌B.tequilensisKCTC 13622的序列相似性在99.58%～99.93%之間，占總分離菌株數的52%，推測B.tequilensis為當地油茶產區內生細菌的優勢類群。有學者表明，從解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)中檢測到存在促生長的植物激素IAA[15]，同時，本研究在平板對峙實驗中發現，芽孢桿菌屬的菌株，可能抑制或促進病原菌的生長。另外，菌株6715葉片回接抑菌效果顯示與平板對峙結果有高度的相關性，而對于該菌株盆栽活體苗的回接效果有待進一步研究。

本研究發現菌株6715對油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率為57.59%，經16S rRNA序列分析鑒定為B.tequilensis。據報道B.tequilensis在研究中表現出較好的生防應用能力，Bhattacharya等[16]研究表明，B.tequilensis對番茄枯萎病菌鐮刀菌有高效的拮抗活性。Hui Li[17]在水稻稻瘟病(PyriculariaoryzaeCav.)研究中發現，內生細菌B.tequilensis能夠顯著抑制稻瘟病病原菌的生長。Claudia Guerrero-Barajasa[18]報道了B.tequilensis能夠減輕由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起的牛油果炭疽病的發生，且其對炭疽病菌的抑制率為60%。對其生防機制進行初探，發現菌株6715存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分別與Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種物質相對應，均屬于脂肽家族。研究表明，脂肽類物質是一類由非核糖體途徑合成的具有抗細菌和抗真菌作用屬性的生物活性分子[19]，包含Surfacin、Iturin和Fengycin 3類。研究報道脂肽類物質主要是靠自身的兩親性和與目標物的互作，致使靶細胞膜結構發生改變，從而改變致病菌細胞膜的滲透性，進而控制致病菌的生長[20]。Surfacin是很強的表面活性劑，有研究發現，其與抗菌活性密切相關，能較好的抑制黃單胞桿菌(Xanthomonas)，當缺乏合成與Surfacin相關的防御基因時，抑制效果顯著下降[21];脂肽類Bacylisin在黃瓜枯萎病[Fusariumoxysporum(Schl.) F.spcucumerinumOwen]和辣椒疫霉病(PhytophthoracapsiciLeonian)的生物防治中表現出良好的活性[22];脂肽類Plipastatin通過使鐮刀菌(Fusariumgraminearum)菌絲發生空泡化、菌絲纏繞凝結阻礙菌絲正常分枝，導致菌絲畸形，從而對病原菌表現出良好的拮抗活性[23]。對于菌株6715代謝物是否能有效產生Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種脂肽物質以及菌株6715對油茶炭疽菌的抑制作用機理，尚有待進一步研究。

3.2 結論

本次研究從健康葉片共獲得25株內生細菌，經分子鑒定表明：有88%的菌株屬于芽孢桿菌屬，其中B.tequilensis的分離率最高，占總分離菌株數的52%，推測B.tequilensis為當地油茶產區內生細菌的優勢類群。同時，發現菌株6715(B.tequilensis)對油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率為57.59%。對其生防機制進行初探，發現菌株6715存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分別與Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種物質相對應，均屬于脂肽家族。