鹽酸西那卡塞納米結晶的制備及體外溶出度研究

張慶明,徐云燕,夏 超

0 引 言

鹽酸西那卡塞(cinacalcet hydrochloride,CINA)是美國藥品食品監督管理局(FDA)批準的第一個鈣敏感受體激動劑，成為治療繼發性甲狀旁腺功能亢進的主要藥物[1]。它能有效地抑制甲狀旁腺組織的增殖，減少甲狀旁腺激素的分泌，保護骨骼等靶器官[2]。現有的CINA劑型是Amgen公司的一種商品名為Sensipar?的片劑。然而，Sensipar?片的CINA溶出率緩慢導致其在體內的生物利用度較低[3]。此外，其受食物種類的影響較大，需要與食物一起服用增強吸收，這導致該藥餐前餐后的生物利用度相差較大，因此CINA的臨床應用中患者依從性差[4]。許多學者對此進行了研究：Yang等[5]制備固體分散片來提高CINA的溶解效率；Cao等[6]開發了一種無食物效應的CINA自微乳化給藥系統。有文獻表明納米結晶是一種很有前景的制劑手段，它可以提高藥物的安全性、溶出度、口服生物利用度，以及消除空飽腹狀態之間的差異[7-10]。本研究利用納米結晶制備鹽酸西那卡塞納米結晶(CINA-NCs)來提高CINA的溶解度和體外溶出度，以期提高其生物利用度，從而提高藥效。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥高效液相色譜儀(LA-20A，日本島津)，冷凍干燥機(中國新芝生物科技有限公司)，旋轉蒸發儀(RE-200A，中國上海亞榮生化儀器廠)，馬爾文粒度儀Zetasizer(Nano ZS90，Malven Instruments，英國)，超聲儀(中國寧波善思生物科技有限公司)，差示掃描量熱儀(STA449C，NerzschCo.Ltd，德國)，掃描電鏡(S-4800, Hitachi Ltd,Tokyo, 日本)。X-射線粉末衍射儀(GNR APD2000，意大利)，渦旋混合器(WH-2，中國上海湖西分析儀器廠)，恒溫振蕩培養箱(THz-98B，中國上海益恒科學儀器有限公司)。CINA(純度99%以上)購自江蘇恒瑞藥業有限公司，批號20170603(中國江蘇)。無水乙醇購自無錫亞盛化工有限公司(江蘇)。聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)是從德國巴斯夫公司采購的。滑石粉來自上海阿拉丁生物化學科技有限公司(中國上海)。微晶纖維素(MCC)購自武漢勝天宇生物有限公司(中國湖北)。交聯羧甲基纖維素鈉(CCNa)來源于上海華威藥業科技有限公司(中國上海)。實驗室自制雙蒸水。實驗中使用的其余材料都是分析級的。

1.2方法

1.2.1 納米結晶的制備采用沉淀-超聲法制備CINA-NCs。將100 mg的CINA分散在1 mL的無水乙醇中作為有機相，將100 mg的Soluplus溶解在50 mL的雙蒸水中作為水相。有機相在冰浴中快速注入到水相中。然后用超聲波處理混合物。超聲狀態參數設定為3 s，間隔2 s，400 W，30 min。通過蒸餾脫除乙醇，最終得到CINA-NCs。在制備過程中，考察有機相中CINA濃度、穩定劑濃度、水相與有機相體積比、超聲功率輸入、超聲時間等因素對納米顆粒的質量的影響。通過單因素實驗，選擇Soluplus作為穩定劑，并通過肉眼觀察CINA-NCs的形態，然后測定粒度和多分散指數(polydispersity index，PDI)為評價指標。

1.2.2響應面法(Box-Behnken)設計采用Box-Behnken設計進一步優化處方[11]。設計中考慮了三個因素和三個水平，見表1。這三個因素分別是A：有機相中的CINA濃度、B：穩定劑濃度、C：水相與有機相體積比。實驗由軟件Design-Expert8.0.6 (StatEase Inc.，USA)設計，每個實驗執行3次。

表 1 鹽酸西那卡塞納米結晶制備優化處方的響應面法Box-Behnken設計

1.2.3冷凍干燥采用冷凍干燥機對優化后的CINA-NCs進行冷凍干燥制得凍干粉。將三批凍干樣品放入小瓶中，在低于-60 ℃的冷阱中預凍12 h，然后將樣品在0.01 kPa真空、-50 ℃下冷凍干燥48 h，得到冷凍干燥的CINA-NCs。考察凍干粉在雙蒸水中的再分散性。另外，對凍干前后的顆粒大小和PDI進行評價，以考察凍干前后的差異。

1.2.4凍干CINA-NCs的表征①顆粒大小、PDI和Zeta電位測定。取出適量凍干的CINA-NCs，分散在雙蒸水中。然后將溶液稀釋到合適的濃度。用馬爾文粒度儀測定其粒徑、PDI和Zeta電位，每個實驗進行3次。②差示掃描量熱[12]。采用差示掃描量熱儀(DSC)，以鋁坩堝為參照物，對適量的CINA原料藥、Soluplus、物理混合物(處方比例的CINA、Soluplus)以及凍干CINA-NCs進行分析。加熱范圍為30～250 ℃，速度為每分鐘10 ℃。③X射線粉末衍射測試。分別取CINA原料藥、Soluplus、物理混合物(處方比例的CINA、Soluplus)和凍干CINA-NCs適量，進行X射線粉末衍射儀(XRPD)分析，具體的測試條件為：銅靶，加速電壓：40 kV；加速電流：40 mA；衍射角(2θ) 4°/min，掃描范圍：5～50°[13]。④原料藥、樣品觀察。5 kV加速電壓下，用掃描電鏡(SEM)觀察CINA原料藥和CINA-NCs的形貌[14]。用金-鈀濺射后，對樣品進行觀察。⑤飽和溶解度分析。將過量的CINA原料藥、CINA和Soluplus的混合物和凍干CINA-NCs分別加入5 mL雙蒸水中，渦旋混合。然后將混合物置于恒溫振蕩培養箱中，在25 ℃，300 r/min下孵育48 h，平衡后，將樣品以5000 r/min的速度離心10 min，然后將樣品放入恒溫振蕩培養箱，轉速為300 r/min，孵化48 h，平衡后，將樣品以5000 r/min的轉速離心10 min。上清液過濾(0.45 μm)，適當稀釋后用高效液相色譜法分析飽和溶解度。

1.2.5穩定性研究對凍干CINA-NCs進行室溫下0～6個月的穩定性研究。考察凍干CINA-NCs在室溫下6個月的穩定性。即將凍干的CINA-NCs保存在密閉的小瓶中，定期取出適量的CINA-NCs，在0、1、2、3、6個月的預定時間點進行復溶分析。以粒徑和PDI為評價指標。每個樣品都進行3次分析，以減少誤差。

1.2.6CINA-NCs膠囊的制備及體外溶出度研究以MCC為填充劑，CCNa為崩解劑，滑石粉為潤滑劑，將30 mg凍干CINA-NCs制成膠囊。采用正交試驗設計對膠囊劑的處方進行研究，以不同處方制備的膠囊劑在pH 6.8磷酸鹽緩沖液(PBS)中30 min的累積溶出度進行評價，見表2。以體外溶出度為指標考察膠囊劑的最佳溶出度。以《中國藥典》2015年版方法為基礎，采用漿法測定膠囊、市售片(Sensipar?)和原料藥的體外溶出度。溶出介質分別為pH 1.2鹽酸緩沖液、pH 4.5醋酸緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和水。將樣品放入900 mL的培養基中，攪拌速度為75 r/min，37 ℃，然后在5、10、15、20、30、45、60和90 min取出樣品5 mL，加入等量的緩沖液以保持緩沖液體積恒定。樣品經0.45 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜法測定CINA的含量。

表2 鹽酸西那卡塞納米結晶膠囊劑三因素三水平正交試驗設計

2 結 果

2.1 因素考察

2.1.1 有機相中CINA的濃度當濃度從80 mg/mL增加到120 mg/mL時，粒徑和PDI變化不大，但當濃度大于120 mg/mL時，粒徑和PDI明顯增加。初步測定有機相中CINA的濃度范圍為80～100 mg/mL。見圖1a。

2.1.2穩定劑濃度當CINA濃度為100 mg/mL時，由于弱立體效應，當其他因素保持不變時，隨著穩定劑濃度的增加，粒徑先減小后增大。當穩定劑濃度大于3.5 mg/mL時，由于顆粒的聚集，促進了奧斯瓦爾德熟化。因此，初步確定了Soluplus的濃度范圍為1.5～3.5 mg/mL。見圖1b。

2.1.3水相與有機相的體積比當體積比在30∶1到60∶1時，粒徑變化不大。較大的顆粒尺寸使超聲難以進行，這可能是由于粘性懸浮液在比例為20∶1時造成的，因此最佳的體積比為30∶1～50∶1。見圖1c。

2.1.4超聲波因素隨著超聲時間的延長，粒徑和PDI先減小后增大，見圖1d。最佳超聲時間為30 min，當超聲時間超過30 min時，顆粒尺寸和PDI開始增大。超聲波功率輸入越強，顆粒越小，見圖1e。但是，當功率輸入大于400 W時，由于納米結晶的不穩定性，顆粒尺寸和PDI變大。因此，當功率為400 W時，可以獲得最佳的納米結晶。

a: 有機相中不同CINA濃度；b: 不同穩定劑濃度；c: 不同水相與有機相體積比; d: 超聲時間; e: 超聲功率

2.2配方優化粒徑和PDI隨穩定劑濃度和CINA濃度的增加先減小后增大。在一定范圍內，體積比的增加導致顆粒尺寸和PDI的減小。隨著體積比和穩定劑濃度的增加，粒徑和PDI先減小后增大。見圖2。總的來說，模型揭示了粒徑和PDI在一定范圍內有最小值。A(有機相中的CINA濃度)、B(穩定劑濃度)、C(水相與有機相的體積比)的多項式回歸方程如下：

R1(粒徑)=248.35-53.12A-31.42B-19.82C-27.34AB-17.44AC+ 7.71BC+137.60A2+22.72B2+118.92C2

(R2=0.9941,P<0.0001)

R2(PDI)=0.17-0.034A-0.021B-0.014C-0.017AB-0.011AC+0.005235BC+0.088A2+0.03B2+0.076C2

(R2=0.9934,P<0.0001)

a:有機相中的CINA濃度; b:穩定劑濃度; c: 水相與有機相的體積比

從回歸方程和響應面結果來看，CINA在有機相中濃度為108 mg/mL、Soluplus濃度為2.7 mg/mL、水相與有機相的比例為40∶1時獲得最佳配方。同時，將超聲功率輸入和持續時間設定為400 W，30 min。根據最佳配方，考察顆粒大小為(244±2)nm,PDI為0.168±0.001。

2.3凍干及穩定性研究凍干粉的再分散性研究中發現，制備得到的納米結晶凍干粉的分散率較好，且顆粒大小和PDI變化不大，見表3。

2.4性狀

2.4.1 粒徑、PDI和Zeta電位優化后的凍干CINA-NCs的粒徑為(257.3±13.740)nm，PDI為0.185±0.002，Zeta電位為(-31.7±0.012)mV。

2.4.2差示掃描量熱通過差示掃描量熱法顯示CINA原料藥、Soluplus、物理混合物和凍干CINA-NCs的溫度曲線，見圖3。CINA原料藥在180 ℃時有明顯的吸熱尖峰，而在171 ℃時由于晶體形態的不同也有微弱的吸熱峰。物理混合物的熱像圖與原料藥的相似。此外，在180 ℃時，CINA-NCs的熱像圖中有一個弱吸熱峰。上述現象可以證明CINA-NCs中CINA的結晶狀態在制備和凍干過程中沒有本質上的變化，但是由于晶體更小，所以峰強度變弱。

表3 三批凍干CINA-NCs樣品的再分散性試驗結果

a: CINA原料藥; b: Soluplus;c: CINA原料藥和Soluplus物理混合物; d: CINA納米結晶

2.4.3X-射線粉末衍射XRPD進一步證實了CINA的結晶狀態，見圖4。CINA原料藥在4°、11°、14°、18°和26°處呈現明顯的峰型。由于其無定型結構，Soluplus呈現出駝峰。凍干后的CINA-NCs呈現出CINA的特征峰。但凍干粉末的峰值強度比物理混合物弱。峰值強度的降低可能是由于制備過程中CINA-NCs的粒徑減小所致。

2.4.4掃描電鏡結果CINA原料藥呈棒狀，粒徑分布較寬。而Soluplus具有巨大的球形性。物理混合物清楚地呈現出棒狀CINA原料藥和球形Soluplus的簡單混合物。相比之下，Soluplus顯示為大量的薄片。凍干CINA-NCs的形貌呈寬粒徑范圍的納米球，從圖上方框的放大圖中可以看出，很明顯鑲嵌在Soluplus片狀中。見圖5。

圖4 粉末X射線衍射圖

a: CINA原料藥;b:Soluplus;c: CINA原料藥和Soluplus物理混合物;d: CINA納米結晶[D(2)為圖中小紅框的局部放大圖]

2.4.5飽和溶解度25 ℃時，CINA原料藥、物理混合物和凍干CINA-NCs在雙蒸水中的飽和溶解度分別為35.20 μg/mL、178.53 μg/mL、2.67 mg/mL。凍干粉的溶解度明顯大于原料藥和物理混合物，進一步表明納米結晶能顯著提高CINA的溶解度。

2.5穩定性研究根據長期穩定性研究結果，粒徑和PDI差異不明顯，見表4。結果表明，冷凍干燥的CINA-NCs在室溫下0～6個月物理性質穩定,符合要求。

表4 CINA-NC凍干粉的穩定性試驗結果

2.6膠囊的最佳處方及體外溶出度研究膠囊的最佳配方由30 mg凍干CINA-NCs、30%(w/v)MCC、8%(w/v)CCNa和2%(w/v)滑石粉組成，見表5。制備的CINA-NCs膠囊在四種不同介質中的累積溶出度值均大于95%，溶出速率明顯大于市售片劑和原料藥。此外，通過數據可以證實膠囊的溶解不受pH值的影響。見圖6。

表5 膠囊處方篩選的正交試驗設計及結果(%,w/v)

a:pH 1.2 鹽酸緩沖液; b：pH 4.5 醋酸緩沖液; c：pH 6.8 PBS;d：水

3 討 論

本研究采用沉淀-超聲法制備CINA-NCs。采用單因素法進行初步優化，并采用Box-Behnken設計法成功篩選出最優處方。采用冷凍干燥法對CINA-NCs進行干燥，并用DSC和XRPD對其進行了表征，表明其結晶狀態沒有本質的變化，DSC峰值強度的降低可能是由于制備過程中CINA-NCs的粒徑減小所致。根據Noyes-Whitney方程，具有大表面積的小顆粒尺寸可以增加溶解速率[15-16]，所以制備的CINA-NCs溶出度較高。溶出度研究進一步證實了該納米結晶具有促進溶出的作用。利用掃描電鏡對凍干后的CINA-NCs進行了形態觀察，進一步證明了在制備過程和凍干過程中，CINA-NCs的結晶狀態變化不大。

因為市售Sensipar?在pH 4.5的醋酸緩沖液中的累積溶出度最高，在pH 1.2的鹽酸緩沖液中以80.5%位居第二。然而，在pH 6.8 PBS中的累積溶解率僅為40.01%，這證實了Sensipar?的溶解度取決于pH值。實驗中發現CINA原料藥在pH 1.2鹽酸緩沖液、pH 4.5醋酸緩沖液、pH 6.8 PBS和水中的累積溶出度分別為17.45%、19.98%、5.12%和16.79%，溶出率極低，且受pH值的影響較大。然而，本實驗制備CINA-NCs膠囊在四種不同介質中的累積溶出度值均大于95%，溶出速率明顯大于市售片劑和原料藥。此外，實驗數據表明本實驗制備的膠囊溶解性能不受pH值的影響。

綜上所述，納米結晶是一種很有前途的技術，CINA-NCs可以改善難溶性藥物CINA的溶解度，提高口服生物利用度，從而提高藥效。