液相色譜串聯質譜技術在罕見病診斷中的臨床應用

禹松林，王丹晨，鄒雨桐，馬曉麗，邱 玲

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院檢驗科 疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京 100730

近年來，液相色譜串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)技術在臨床檢驗領域受到廣泛關注。其因特異度高、可同時區分/定量多種代謝物等特點，正逐漸從科研應用走向臨床實踐前沿。一方面，在目前常規生化免疫學尚無成熟檢測方法的情況下，LC-MS/MS技術可作為臨床亟需項目的重要補充；另一方面，作為鑒別檢測干擾物的利器，LC-MS/MS技術可標化不同分析系統檢驗結果的一致性，對同一待測物質不同結構亞組進行準確定量分析，從而在臨床精準診斷中發揮越來越大的作用。罕見病患者僅占全球人口的0.65‰～1‰，但病種多達7000多種，且臨床表現差異大，診斷非常困難。為加強我國罕見病防治管理、提高罕見病診療水平，2018年國家衛生健康委員會聯合五部門制定了《第一批罕見病目錄》，納入了121種罕見病。目前罕見病體外診斷領域的主要關注點集中于基因突變檢測方面，而對具有篩查、診斷及鑒別診斷作用的代謝物、激素等的定量檢測則缺乏完整的解決方案。LC-MS/MS技術具有同時準確定量分析多種物質的能力，可以對罕見病的早期診斷及治療監測提供有力的實驗室幫助。目前，LC-MS/MS技術已在多種罕見病檢測中發揮關鍵作用，本文參考我國《第一批罕見病目錄》，同時納入部分不在此目錄但北京協和醫院接診較多且患病率低于1/10 000的疾病，分析LC-MS/MS技術在其診斷中的應用現狀及前景。

1 激素相關罕見病

目前，睪酮、雌二醇等激素已有相對成熟的免疫學檢測方法，但免疫學方法可檢測的激素項目有限，且不同免疫平臺的檢測結果差異較大。遇到非特異性干擾時，檢測結果可能給臨床診斷帶來困擾，甚至有學者指出，“采用免疫學方法檢測睪酮還不如猜一個結果更加準確”[1]。而LC-MS/MS方法特異度高，在激素檢測中具有巨大優勢。

1.1 類固醇激素相關罕見病

類固醇激素種類眾多，代謝通路復雜，與多種腎上腺及性腺疾病相關。目前基于LC-MS/MS技術可同時檢測幾十種類固醇激素，在一系列類固醇激素相關罕見病如先天性腎上腺皮質增生性疾病及其亞型的診斷和鑒別診斷中發揮著重要作用。21-羥化酶缺乏導致的先天性腎上腺皮質增生(congenital adrenal hyperplasia, CAH)的臨床實踐指南明確指出，免疫學方法測定17α-羥孕酮存在假陽性結果，推薦采用LC-MS/MS作為首選測定方法，以改進CAH的陽性預測結果[2]。CAH亞型種類較多，包括11β-羥化酶缺陷癥、17-羥化酶缺陷癥、21-羥化酶缺陷癥、3β-羥基類固醇脫氫酶缺陷癥等。此外，其臨床表現復雜多樣，不同亞型激素的升高或降低不完全相同，例如，21-羥化酶缺陷癥導致的CAH表現為11-脫氧皮質醇和皮質酮等鹽皮質激素降低，17α-羥孕酮、孕酮、睪酮增高；而11β-羥化酶缺陷癥表現為11-脫氧皮質醇增高，皮質醇和皮質酮降低；3β-類固醇脫氫酶缺陷癥則表現為17α-羥孕烯醇酮和脫氫表雄酮增高，孕酮、17α-羥孕酮、雄烯二酮降低。CAH亞型的臨床診斷及鑒別診斷困難，往往需依賴多種類固醇激素的聯合檢測。目前，對于11-脫氧皮質醇、17α-羥孕烯醇酮等激素的檢測尚無成熟的生化免疫學方法，而LC-MS/MS技術為多種類固醇激素同時、準確檢測提供了可能。近年來，國內外相繼開發出可同時檢測10種以上類固醇激素的LC-MS/MS方法，為CAH亞型的診斷及鑒別診斷提供了幫助[3- 4]。

北京協和醫院檢驗科建立的同時測定25種類固醇激素的方法，在既往報道的20種類固醇激素[4]的基礎上，增加了18-氧皮質醇、18-羥皮質醇、18-羥皮質酮等指標，與醛固酮的聯合應用對于原發性醛固酮增多癥及其亞型、醛固酮分泌瘤及雙側腎上腺增粗具有鑒別意義[5]。然而，基于LC-MS/MS技術獲得的眾多類固醇激素的檢測結果也為檢驗科及初級臨床醫生對于結果的準確判讀提出了挑戰。基于此，北京協和醫院檢驗科根據25種類固醇激素的代謝途徑，制定了以代謝通路為模板的檢驗報告(圖1)。

圖 1 北京協和醫院檢驗科類固醇激素檢驗報告模板

1.2 兒茶酚胺激素相關罕見病

兒茶酚胺(catecholamine, CA)包括多巴胺(dopamine, DA)、腎上腺素(epinephrine, E)和去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)，又可分別代謝為3-甲氧基酪胺(3-methoxytyramine, 3-MT)、3-甲氧基腎上腺素(metanephrine, MN)、3-甲氧基去甲腎上腺素(normetanephrine, NMN)等。CA及其代謝物的檢測在嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(pheochromocytomas and paragangliomas，PPGLs)的篩查、診斷及治療監測中起著決定性作用。PPGLs起源于腎上腺及腎上腺外的嗜鉻細胞，發病率較低，約占高血壓患者的0.1%～0.6%。國內外多個關于PPGLs的診療指南[6- 7]均指出，PPGLs診斷首選的生化指標為血游離或尿分餾MN和NMN， NE、E和DA可協助診斷，并推薦采用LC-MS/MS或液相色譜串聯電化學檢測器進行檢測。多個研究數據顯示，血游離MN和NMN的檢測結果對PPGLs的診斷靈敏度及特異度均達90%以上，而尿CA的診斷靈敏度(69%～92%)和特異度(72%～96%)較代謝物MN和NMN稍低[6- 7]，且CA更易受患者情緒(應激/焦慮)、活動(運動)以及飲食(酒精/咖啡)等影響。盡管LC-MS/MS技術測定CA及其代謝物優勢明顯，但為保證結果的可靠性，需嚴格控制影響因素，如藥物、樣本采集后的放置條件等[8- 10]。

2 遺傳性代謝障礙相關罕見病

新生兒遺傳性代謝障礙多為罕見病，其患病率約為16.25/10 000，主要包括氨基酸代謝病(如苯丙酮尿癥、高苯丙氨酸血癥)、有機酸代謝病(如丙酸血癥、戊二酸血癥)和脂肪酸代謝病(如原發性肉堿缺乏癥)等[11]。串聯質譜(tandem mass spectrometry，TMS)技術是其首選測定方法[12]。基于TMS技術，通過幾滴血、一次檢測便可在幾分鐘內測定幾十種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮等化合物，滿足對多種新生兒遺傳性代謝障礙同時篩查的需求。歐美等發達國家已將其列為法定篩查項目，在我國部分大中城市也已相繼開展[13]。然而，TMS技術不經過色譜分離，無法區分同分異構體，同時存在其他代謝物干擾的風險，因此在一些特殊情形下，對TMS技術檢測陽性的樣本采用LC-MS/MS或氣相色譜串聯質譜(gas chromatography-tandem mass spectrometry, GC-MS/MS)技術進行二次篩查具有重要意義。

甲基丙二酸血癥(methylmalonic acidemia，MMA)作為一種嚴重異質性丙二酸甲酯和鈷胺素(維生素B12)代謝性疾病，可造成多臟器(肝臟、腎臟等)損害，致死率較高且存活者預后不良[14- 15]。MMA在中國較為常見，由于其臨床異質性大，易造成漏診或誤診[16]。因此，早期診斷、治療至關重要。基于TMS技術測定干血斑中肉堿水平是臨床提示MMA的重要指標，然而該方法缺乏特異性，陽性預測值較低，很難實現與丙酸血癥等的準確鑒別診斷。因此，推薦對新篩陽性樣本進一步采用LC-MS/MS技術進行二次篩查[17]。盡管采用免疫學方法可實現維生素B12的測定，但其易受內因子抗體干擾而出現測定結果假性正常或增高的現象[18]。基于LC-MS/MS技術不僅可實現維生素B12、甲基丙二酸的準確測定，亦可與其代謝產物琥珀酸相區分，從而有效降低MMA篩查的假陽性率，且該方法無需衍生化步驟，相比GC-MS/MS技術操作更簡單、快速[15]。

基于LC-MS/MS技術可同時準確定量多種脂肪酸，對X-連鎖腎上腺腦白質營養不良(X-linked adrenoleukodystrophy，X-ALD)等罕見病的輔助診斷具有重要價值。X-ALD由于ABCD1基因突變、過氧化物酶體代謝極長鏈脂肪酸障礙，導致極長鏈脂肪酸在腎上腺、腦白質等部位蓄積，進而影響腎上腺和腦白質功能，其在男性中的發病率約為1/21 000。由于本病尚無有效的治療手段，攜帶者的檢出和產前診斷意義重大。常見的極長鏈脂肪酸包括C22∶0、C24∶0和C26∶0，研究顯示基于TMS技術評估干血斑中極長鏈脂肪酸，特別是C26∶0與C22∶0的比值可快速、簡便、可靠地篩查X-ALD及其他過氧化物酶體疾病[19]，而基于LC-MS/MS技術準確定量血漿中的C26∶0和C24∶0，可作為進一步診斷的方法，其鑒別X-ALD的特異度可達100%[20]，此外，基于LC-MS/MS技術可同時檢測羊水和血液中C22∶0、C24∶0、C26∶0等的水平，檢測性能良好、無需衍生化[21]。

基于LC-MS/MS技術可快速準確測定體液中氨基酸、脂肪酸、有機酸及肉堿等代謝物質的水平，輔助相關疾病篩查，降低TMS技術初篩的假陽性率。但值得注意的是，氨基酸、脂肪酸及有機酸等代謝相關的罕見病多為遺傳性疾病，質譜方法大多僅可作為篩查、輔助診斷及治療監測的手段，最終的確診和鑒別診斷仍依賴于酶活性測定和/或基因檢測。

3 維生素代謝相關罕見病

據文獻報道，低磷性佝僂病這一罕見病患者表現為25OHD3正常或稍低，1,25(OH)2D3則由于1α-羥化酶受到成纖維細胞生長因子抑制而明顯降低[22- 23]。在CYP24A1突變導致的特發性高鈣血癥患者中，25OHD失活途徑受阻，導致無法代謝生成24,25(OH)2D，體內24,25(OH)2D含量明顯降低。2016年Ketha等[24]指出25OHD與24,25(OH)2D的比值可作為篩查CYP24A1突變的常規臨床檢查指標，并建議對臨床不明原因的高鈣血癥患者，采用LC-MS/MS檢測25OHD與24,25(OH)2D的比值以篩查CYP24A1突變[24]。目前免疫學方法可測定25OHD以及1,25(OH)2D3，但傳統的免疫學檢測方法易受非特異性交叉干擾，導致檢測結果不準確[25]，且免疫學方法存在無法區分維生素D2和D3亞型，測定范圍較窄等問題。而LC-MS/MS具有特異度好的優勢，可同時分析維生素D及其代謝物等多種亞組成分[26- 27]，因此其在需對維生素D及其代謝物進行區分的維生素D代謝相關罕見病中日漸受到臨床認可。北京協和醫院檢驗科亦于2018年率先在國內建立了LC-MS/MS同時測定25OHD和24,25(OH)2D的方法[25]， 在CYP24A1突變導致的特發性高鈣血癥、低磷性佝僂病等的篩查及治療監測中發揮了重要作用。

4 IgG4相關性疾病

近年新命名的IgG4相關性疾病(IgG4 related disease，IgG4-RD)是一類原因不明的慢性、進行性炎癥伴纖維化和硬化的疾病，主要特征為血清IgG4水平顯著增高。研究顯示，血清IgG4濃度診斷IgG4-RD的靈敏度和特異度分別為87.2%和82.6%[28]，但其采用不同方法測定具有不同的臨界值，通常采用的定量方法是自動免疫比濁法。盡管免疫比濁法應用廣泛，但存在校準差異[29- 31]和抗原過量干擾(“鉤”效應)[32- 33]等局限性。采用LC-MS/MS可在一次進樣中完成對4種IgG亞型及IgG總量共5個指標的同時測定，且IgG亞型的加和值和直接測得的IgG總量的相關性優于免疫比濁法[34]。有研究分別采用免疫比濁法和LC-MS/MS對75例患者樣本的IgG亞型進行測定，發現兩種方法的結果并不一致，IgG2抗體與IgG4抗體存在交叉干擾，導致免疫比濁法分開測定4種亞型IgG的加和值高于直接測得的IgG總值，而采用LC-MS/MS測得的各亞型的加和值與總值接近(70例結果偏差在20%以內)[35]。

5 帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)雖被界定為罕見病，但隨著中國老齡化進程加速，PD作為除阿爾茨海默病外最常見的神經退行性疾病，其發病率越來越高，目前僅可通過臨床癥狀診斷，并無明確的生物學指標。有研究采用代謝組學手段，利用高分辨質譜技術準確定性的能力對可能的PD生物標志物進行了探索，并發現N1,N8 -二乙酰亞胺可能是診斷PD的生物標志物[36]。此外，有報道稱嘌呤代謝物是PD惡化或改善的臨床相關生物標志物，而基于LC-MS/MS技術可實現6種嘌呤分子的同時測定[37]。未來，LC-MS/MS技術有望在PD診治中發揮重要作用。

6 前景與挑戰

隨著LC-MS/MS技術的不斷進步，其臨床應用越來越廣泛，并在CAH、PPGLs、MMA、X-ALD等多種罕見病的篩查、診斷、鑒別診斷以及治療監測中嶄露頭角。然而，LC-MS/MS技術在推廣應用過程中仍存在較大挑戰：首先，LC-MS/MS技術目前尚存在自動化程度低、儀器昂貴、配套試劑和質控品不成熟等問題，造成實驗室人員工作量較大；其次，罕見病指標繁多，國內研究較少，缺乏基于LC-MS/MS檢測方法的國內人群參考區間，特別是對于受到月經周期、年齡、性別等影響的指標，建立其人群參考區間面臨巨大挑戰；此外，某些臨床有需求的項目尚未建立收費標準，致使工作進一步開展受到限制。然而，隨著國家對罕見病關注度的提高以及國內外醫療器械生產廠商、醫療應用機構對LC-MS/MS技術的不斷研發，目前存在的問題正在逐步被解決。總之，LC-MS/MS技術在臨床檢測領域已展現出強大優勢，不僅可與現有生化免疫技術實現互補，未來在發現及驗證罕見病新的生物標志物方面亦將發揮不可估量的作用。

作者貢獻：禹松林負責整理文獻、撰寫論文；王丹晨、鄒雨桐、馬曉麗負責文獻查閱與收集；邱玲負責修訂、審核論文。

利益沖突：無