基于網絡藥理學研究黃芪治療膜性腎病的作用機制

龐欣欣，彭紫凝，邢玉鳳，石秀杰，張雅歌，韓佳瑞,*，王振濤,*

(1 河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)腎病科，鄭州 450002；2 河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州 450046)

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是導致成人腎病綜合征的主要病因之一[1]。MN約占原發性腎小球腎炎30%，且呈逐年上升趨勢[2]。MN多見于40歲以上人群，主要臨床表現為水腫、蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和高血壓，少數伴有鏡下血尿[3]。MN的病理特征為腎小球基底膜上皮側免疫復合物沉積，伴有腎小球基底膜彌漫增厚[4]。目前，MN的發病機制尚未明確，主要治療方法以控制血壓、降低尿蛋白、糾正脂代謝紊亂、利尿消腫及免疫抑制治療等為主[5]，但是仍有約30%患者進入終末期腎臟疾病，依賴腎透析[6]。

中醫藥在治療MN上有獨特的優勢，已逐漸被國內外接受[5,7]。黃芪(Astragalus membranaceus)是治療MN的中藥之一，不僅可以大劑量單獨應用，還可作為君藥組方配伍使用治療MN[8-9]。黃芪具有補氣升陽、固表止汗、行水消腫等功效，有“補氣諸藥之最”之稱。西醫學研究證實黃芪能通過抗炎、抗氧化、改善腎小球濾過、調節免疫系統、改善水鈉代謝等多方面緩解腎臟疾病[10]。本研究通過網絡藥理學的方法挖掘黃芪的有效成分及靶點，利用復雜的網絡可視化技術，引入黃芪作用于MN的靶點，進行疾病-藥物-分子-靶點互相作用的可視化分析，以及基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析，為黃芪治療MN的中醫機制研究提供依據。

1 方法

1.1 黃芪有效成分篩選

通過檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[11]挖掘黃芪的化學成分，根據各個成分的吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)，即ADME參數篩選有效成分，其中篩選條件為藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug like，DL)≥0.18。

1.2 黃芪的作用靶點和MN的相關靶點檢索

以“Astragalus membranaceus”為關鍵詞，篩選TCMSP數據庫中黃芪有效成分作用靶點。以“membranous nephropathy”為關鍵詞，篩選GeneCards、DrugBank、TTD、DisGeNET等數據庫中與MN有關的靶點。

1.3 PPI網絡構建和關鍵靶點篩選

蛋白質與蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)是數據挖掘的重要途徑。STRING數據庫可以預測蛋白質之間的相互作用關系并構建PPI網絡。依據STRING數據庫構建黃芪作用靶點與MN靶點的交集PPI網絡并篩選核心靶點。篩選參數設置主要有：生物機體選擇為人類，最低要求交互分數設置最高置信度為0.4。

1.4 黃芪治療MN網絡調控可視化

基于黃芪和MN的PPI靶點數據，篩選得到黃芪可作用于MN的有效成分，采用Cytoscape 3.7.2軟件把這些數據制作成可視化網絡圖，其中“圓形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“邊”表示不同成分與靶點之間的關系，挖掘其相互之間的作用關系。即得到黃芪治療MN的疾病-藥物-分子-靶點調控網絡圖。

1.5 GO和KEGG富集分析

采用DAVID(the database for annotation，visualization and integrated discovery)數據庫對有效靶點進行注釋，并挖掘黃芪化合物的靶點蛋白在基因功能中的作用，進行GO和KEGG富集分析[12]。GO分析是生物學領域中用于基因產物細胞功能、分子功能和生物功能分類的系統，可以通過DAVID工具進行GO富集分析。同時，應用DAVID工具對黃芪和MN交集蛋白靶標基因進行KEGG通路富集分析，得到黃芪治療MN的主要作用通路。采用校正統計學超幾何分布定量(P.adjust值)評估存在于各GO和KEGG注釋中的蛋白生物學功能和通路富集情況的顯著性，P.adjust值在圖中顏色越紅，則顯著性越強。

2 結果

2.1 黃芪有效成分ADME分析

檢索TCMSP數據庫中黃芪的化學成分，按照OB≥30%和DL≥0.18條件篩選出20個黃芪入血活性成分，有良好的口服生物利用度和藥物相似性。見表1。

表1 黃芪有效成分

2.2 黃芪作用靶點和MN相關靶點檢索結果

通過TCMSP數據庫查找到的20個有效成分中，只有15個有效成分具有相對應的靶點。對這15個有效成分進行靶點基因注釋，刪去重復靶點，得到180個藥物靶點。在GeneCards、DrugBank、TTD、DisGeNET等數據庫中篩選MN相關靶點，刪除重復值，共得到3191個與MN相關的靶點。取黃芪和MN的有效靶點交集，得到121個共同靶基因。

2.3 黃芪-MN作用靶點PPI關系分析

采用STRING數據庫對黃芪-MN的121個相互作用靶點進行PPI分析，隱藏離散節點，得到1456條PPI關系。見圖1。取其中富集節點數目最多的前30個靶點，做柱狀圖，得到前30個黃芪-MN核心靶點。橫軸為富集節點數目，縱軸為靶點基因名稱。核心靶點主要有蛋白激酶、炎癥因子、血管內皮生長因子、細胞凋亡相關因子等。見圖2。

圖2 黃芪治療MN的核心作用靶點

2.4 黃芪治療MN網絡可視化分析

通過Cytoscape軟件進行黃芪治療MN的疾病-藥物-分子-靶點互相作用的可視化分析。納入上述PPI網絡篩選的121個基因和分析篩選得到15個黃芪可用有效成分，同時在網絡中加入疾病和藥物使網絡圖更加直觀。網絡可視化圖見圖3。

2.5 黃芪治療MN的機制分析

通過DAVID工具對黃芪和MN交集蛋白靶標基因進行GO分析，得到黃芪可治療MN的作用靶點的生物學功能128種，綜合分析后取前20種功能特性，得到黃芪有效成分靶點主要通過這些生物學功能特性治療MN，如細胞因子受體結合性、受體配體活性、DNA結合轉錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ型特異性、細胞因子活性等。見圖4。再采用DAVID工具進行KEGG信號通路分析，探索黃芪治療MN信號通路28條，綜合分析后取前20條信號通路。KEGG分析顯示，黃芪治療MN的有效靶點主要作用在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路、缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號通路、內分泌抵抗力(endocrine resistance)、腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system,RAS)信號通路等。見圖5。其中氣泡顏色越紅，則校正P值越高，顯著性越強；氣泡越大，則該生物學功能或該通路富集的靶點越多。根據顯著性和富集靶點數目進行綜合分析得到MAPK信號通路為最關鍵的治療通路，同時用紅色表示黃芪靶點在該信號通路上具體作用點。見圖6(所有結果均符合P.adjust<0.05)。

注：六邊形代表黃芪，菱形代表MN，三角形代表黃芪15個有效作用成分，圓形代表黃芪作用于MN的121個靶點。其中A代表(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol；B代表9,10-dimethoxypter ocarpan-3-O-β-D-glucoside；C代表(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol；D代表1,7-dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene圖3 黃芪-MN-有效成分-靶點網絡關系圖

注：計數代表與該生物學功能相關的靶點數量，P.adjust表示顯著性圖4 黃芪治療MN的相關生物學功能

注：計數代表與該通路相關的靶點數量，P.adjust表示顯著性圖5 黃芪治療MN關鍵信號通路

注：紅色表示黃芪在信號通路上的作用靶點(來源于KEGG PATHWAY數據庫)圖6 MAPK信號通路圖

3 討論

MN占原發性腎病綜合征的20%～35%，是國內外常見的引起腎病綜合征的病理類型之一[1]。近年來，MN患病率逐年上升，其發病機制復雜，臨床治療困難，雖然大多數MN患者患病后及時對癥治療，能夠緩解部分臨床癥狀，但是仍有近1/3的患者不可避免進入終末期腎臟疾病，最終依賴腎透析[6]。因此，仍需要探索新的干預手段緩解MN進展，其中中醫藥治療方法優勢明顯。

MN在中醫學中尚無直接對應的病名，依據其臨床表現可劃分為“水腫”“虛勞”等范疇[13]。在MN的發展過程中，多數醫家認為MN屬本虛標實證，病機以腎、脾、肺等臟腑功能失調為主，以腎虛為根本病位[14]。研究表明[15]，MN不同時期的病因病機不同，初期多為正虛邪實，后期則為脾腎陽虛，腎氣虛，脾失健運，水濕泛溢于肌膚，發為水腫，精微不固則下泄為蛋白尿，故脾腎氣虛為基本病機，貫穿始終。研究表明[16]，MN病機之本主要為脾腎氣虛，瘀水互結。因此，MN的中醫辨證與脾腎氣虛密切相關，治療當以補氣為主?！吨袊幍洹?020年版記載黃芪性甘，微溫，歸肺、脾經，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效，為補氣之要藥，功效符合MN的中醫治則[17]。國內外研究證實黃芪為治療MN的核心中藥之一，能夠緩解MN進展[8-9]。

目前，黃芪治療MN的作用機制尚不完全清楚。如項協隆等[18]認為黃芪有效成分可以通過調控蛋白激酶R樣內質網激酶通路抑制內質網應激，緩解膜性腎炎大鼠的腎損傷。Zheng等[19]發現黃芪成分能夠改善足細胞形態及細胞骨架受損，抑制細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化，黃芪作用于MN的機制可能與其有效成分能夠調節細胞骨架蛋白及相關通路來減輕足細胞損傷有關。

網絡藥理學具有與中醫藥學基本特點一致的整體性和系統性，注重藥物與疾病之間的相互作用，能把傳統中藥與現代藥理學良好銜接，彌補臨床用藥安全性監測的不足，能在理論層面探索藥物對疾病的作用機制[20]。本研究應用網絡藥理學探索了黃芪作用于MN的潛在分子機制。研究分析黃芪治療MN有效入血的活性成分及靶點，得到黃芪主要通過槲皮素(quercetin)、毛蕊異黃酮(calycosin)、山柰酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)等有效成分，作用在MN多個靶點，如蛋白激酶1(AKT1)、炎癥因子白介素-6(IL-6)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、細胞凋亡相關因子CASP3等。有研究表明，AKT可能參與藥物治療MN過程，其作用機制可能與保持足細胞骨架及足突完整有關[21]；VEGF可能在MN的發病機制中具有雙重調節作用[22]；藥物抑制IL-6表達能緩解MN炎癥反應進而保護腎臟[23]等。通過GO分析得到這些有效作用靶點主要通過細胞因子受體結合性、受體配體活性及細胞因子活性等生物學功能特性治療MN。

為進一步探索黃芪治療MN的作用機制，本研究針對黃芪-MN之間PPI關系的所有靶點進行KEGG關鍵通路富集分析，結果顯示，黃芪治療MN主要通過MAPK信號通路、HIF-1信號通路、內分泌抵抗力、RAS信號通路等。依據富集靶點及顯著性分析得到黃芪治療MN關鍵信號通路為MAPK信號通路。本研究中，黃芪主要作用于MAPK信號通路包含的p38、ERK、JNK三個亞族，行使不同功能。其中，p38是MAPK信號通路的主要分支之一，通過調控p38調節活化蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase,PRAK)等激活低分子量熱休克蛋白27(HSP27)，參與細胞的炎癥應激反應，與細胞增殖、凋亡等多種生物學特性密切相關[24]。JNK介導的通路可被細胞因子、氧化應激、生長因子等多因素激活，ERK可調控細胞的多種生理功能，在多種疾病中發揮重要作用等[25]。與本研究一致，Hong等[26]認為抑制MAPK信號通路中p38、JNK的表達能保護足細胞免受補體復合物誘導的損傷。研究證實[19]，黃芪提取物能通過減少補體膜攻擊復合物誘導的JNK和ERK1/2的磷酸化來影響MAPK信號通路，恢復足細胞形態避免MN加重。因此，以MAPK信號通路針對MN靶向治療有一定的優勢，黃芪治療MN的具體機制可通過該通路進行挖掘研究。

本研究仍存在不足之處：① 網絡藥理學研究是基于已有的中藥活性成分數據庫，可能存在尚未發現的黃芪有效成分，研究結果不夠全面。② 研究預測的活性成分-靶點之間具有關聯性，但是兩者之間的具體調控關系及靶點在KEGG分析所得的通路中的調控作用依舊不明。③ 分析所得的結果需進行體內或體外實驗驗證，缺少黃芪治療MN的多中心大樣本隨機對照的臨床研究，本課題組后續將以此為研究基礎，進行實驗研究，也為廣大研究人員提供思路，深入探索黃芪治療MN的具體作用機制。

綜上所述，本研究通過對黃芪治療MN的網絡藥理學挖掘，得到黃芪主要通過槲皮素、毛蕊異黃酮、山柰酚等有效成分具體作用在MN的AKT1、IL-6、VEGFA等多靶點，其主要生物學功能特性為細胞因子受體結合性、受體配體活性及細胞因子活性等，作用的關鍵通路為MAPK信號通路。黃芪可能直接或間接參與調節炎癥、細胞凋亡、氧化應激等作用機制影響MN。本研究為后續臨床驗證及深入基礎研究提供了重要的參考依據。