枯草芽孢桿菌蛋白酶基因的密碼子分析

張榮宗，江丁文，陳錦香

（惠安縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，福建 惠安 362100）

枯草芽孢桿菌是一種有益菌，廣泛分布在土壤、空氣、水和腐敗的有機(jī)物中。它是一種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，大小為1.5μm×3.0μm，菌落粗糙、褶皺，能夠運(yùn)動(dòng)，具有可休眠的芽孢結(jié)構(gòu)。其中芽孢由芽孢衣和皮層等組成，可以抵抗不良環(huán)境的影響[1-2]。枯草芽孢桿菌能夠消毒抑菌防腐，可以分泌多種酶和抑菌物質(zhì)，阻止病原菌生長(zhǎng)，使植物在表皮層形成保護(hù)膜[3]。除此之外，它還能夠促進(jìn)動(dòng)物腸道有益菌生長(zhǎng)、水生態(tài)環(huán)境修復(fù)、糞污除臭、殺滅寄生蟲(chóng)和卵、減少蚊蟲(chóng)蒼蠅等的滋擾[4-5]，對(duì)鈾、錳、砷等重金屬富集[6]，起到促進(jìn)生殖生長(zhǎng)激素分泌、修復(fù)創(chuàng)傷感染、保護(hù)神經(jīng)元、抗腫瘤活性、促血管擴(kuò)張、營(yíng)養(yǎng)保健、減少蛋白過(guò)敏源和增強(qiáng)動(dòng)物免疫力[7]等作用。枯草芽孢桿菌可應(yīng)用在生態(tài)發(fā)酵、微生物醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物生產(chǎn)和保護(hù)、消毒殺蟲(chóng)、基因宿主細(xì)胞表達(dá)、生物制劑和生物防治、糞污環(huán)境污染控制等方面[8]。

在生物核酸基因轉(zhuǎn)錄翻譯中，氨基酸的密碼子在選擇上存在偏好性，通過(guò)密碼子優(yōu)化增加宿主細(xì)胞中的最優(yōu)密碼子及次優(yōu)密碼子，可以使表達(dá)量提高幾倍甚至幾十倍[9-10]。為獲得特定基因的表達(dá)蛋白，可先擴(kuò)增不含信號(hào)肽和前導(dǎo)肽的編碼基因，擴(kuò)增片段連接質(zhì)粒載體構(gòu)建質(zhì)粒重組體，然后將連接產(chǎn)物CaCl2法轉(zhuǎn)化原核菌株或者電轉(zhuǎn)化真核菌株，表達(dá)成熟的蛋白，最后運(yùn)用SDS-PAGE和免疫印跡法檢測(cè)蛋白[11-13]。其中，核酸基因的表達(dá)系統(tǒng)有以己糖類等為底物的大腸桿菌，以甲醇為碳源的畢赤酵母，保留野生菌株活性的枯草芽孢桿菌蛋白酶，以及病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。

枯草桿菌蛋白酶是堿性絲氨酸水解酶，包括解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶BPN’、地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶Carlsberg和枯草芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶E，以及其他芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，可以水解合成過(guò)氧乙酸，用在洗滌劑、漂白劑、添加劑、制革、絲綢等方面，其催化中心活性由結(jié)合O到結(jié)合S、Se逐漸減弱[14-18]?？莶菅挎邨U菌的枯草桿菌蛋白酶，能減少有毒有害物質(zhì)成分的殘留，對(duì)真菌產(chǎn)生抑制作用，快速發(fā)酵分解糞污，是良好的生物安全控制劑。為了合理運(yùn)用枯草芽孢桿菌，可使用基因重組雜交、連接轉(zhuǎn)化、突變等方法，對(duì)基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，提高枯草芽孢桿菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量[19-20]。

本文引用的序列數(shù)據(jù)主要用來(lái)了解基因分子生物信息學(xué)、進(jìn)化和結(jié)構(gòu)等，以期對(duì)信息進(jìn)行比較利用，不負(fù)責(zé)侵權(quán)責(zé)任，其中優(yōu)化的密碼子序列為成熟蛋白酶基因序列。通過(guò)分析枯草芽孢桿菌蛋白酶的作用，實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞中表達(dá)，將有助于畜牧業(yè)、特種養(yǎng)殖、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生態(tài)發(fā)展，穩(wěn)產(chǎn)保供和糞便集中統(tǒng)一無(wú)害化處理，有助于對(duì)流浪寵物、鳥(niǎo)類、野生動(dòng)物等公共動(dòng)物資源的生態(tài)管理和節(jié)育保護(hù)或利用，有助于動(dòng)物生理的健康繁殖發(fā)育和巡查檢驗(yàn)。

1 編碼基因密碼子組成分析

根據(jù)genebank（登錄號(hào)：MK673996.1）公開(kāi)的芽孢桿菌蛋白酶編碼基因序列，通過(guò)SignalP-5.0分析，去除31個(gè)氨基酸信號(hào)肽，取不含前導(dǎo)肽的序列分析密碼子；根據(jù)DNAman分析，枯草芽孢桿菌成熟蛋白酶基因的酶切位點(diǎn)Eco56 I位于39位，Pvu II位于817位?？莶輻U菌蛋白酶編碼基因堿基含量見(jiàn)表1、表2，密碼子第1位GC含量為53.99%，密碼子第2位含量為52.54%，密碼子第3位含量為40.22%，密碼子GC含量依次遞減，GC總含量為48.91%，密碼子第3位含量以A、T為主。

表1 枯草桿菌蛋白酶編碼基因堿基含量Tab.1 Base content of subtilisin coding gene

表2 枯草桿菌蛋白酶編碼基因堿基含量（2）Tab.2 Basecontent of subtilisin encoding gene

密碼子有效數(shù)（Effective number of codons，Nc）表示基因轉(zhuǎn)錄氨基酸所使用的密碼子類型數(shù)量，一般數(shù)值在20~61。Nc值越小，說(shuō)明該基因密碼子偏性越強(qiáng)；反之，說(shuō)明該基因密碼子偏性越弱，使用的稀有密碼子較多，表達(dá)效率低。密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaption index,CAI）表示基因完全使用高表達(dá)基因的密碼子程度，其數(shù)值范圍在0~1，數(shù)值越大，越接近高表達(dá)基因使用的密碼子?？莶輻U菌蛋白酶編碼基因Nc值為42.677，CAI值為0.647，均處于中等偏性，可對(duì)其密碼子進(jìn)一步優(yōu)化。

2 相對(duì)同義密碼子使用度分析

相對(duì)同義密碼子使用度(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU)指編碼同一種氨基酸的密碼子間的相對(duì)概率，當(dāng)RSCU大于1時(shí)，表示密碼子使用偏性較高，其為優(yōu)勢(shì)密碼子。同義密碼子的改變會(huì)使mRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定改變而影響翻譯效率，盡可能使表達(dá)的基因同義密碼子與宿主的密碼子用法一致，或者調(diào)整α螺旋中間非結(jié)構(gòu)部分翻譯速度，將有助于提高基因表達(dá)水平。選擇合適的表達(dá)載體和啟動(dòng)子（pET20b-T7、Pcold-cspA、pET28a(+)-T7、pPIC3.5K-AOX1等）、匹配度高的信號(hào)肽（PelB、OmpA等）等，可使表達(dá)更加穩(wěn)定。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘氨酸、SDS、吐溫-20、CTAB、蔗糖、Na+、Mg2+、Ca2+等添加物，可以提高細(xì)胞膜通透性以提高蛋白的分泌，但可能存在阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)的問(wèn)題。密碼子偏好性的另外一個(gè)原因是不同宿主細(xì)胞的tRNA豐度不同，可通過(guò)過(guò)量表達(dá)tRNA來(lái)識(shí)別稀有密碼子以減少密碼子偏性[9]。

密碼子使用頻率（Codon Usage，CUSP）是指基因密碼子在編碼中的使用頻率。利用一定的宿主細(xì)胞（E.coli BL21、P.pastoris SMD1168、B.megaterium MS941等）進(jìn)行表達(dá)時(shí)，要考慮表達(dá)基因和宿主細(xì)胞載體的CUSP、優(yōu)勢(shì)密碼子盡可能一致。提高基因表達(dá)水平的方法，一是通過(guò)DNA編碼結(jié)構(gòu)鏈或信號(hào)肽密碼子優(yōu)化，減少稀有密碼子，調(diào)整GC含量；二是防止中間出現(xiàn)終止密碼子或者待切酶切位點(diǎn)；三是對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，利用特異性引物等合成改造新的編碼序列（固相亞磷酰胺三酯法、二步重疊PCR法、熱力學(xué)平衡由內(nèi)向外TBIO法等）[21]。在優(yōu)化過(guò)程中要盡量避免第2位、第3位堿基出現(xiàn)GC、TA，防止真核生物甲基化喪失基因活性。同時(shí)，要避免出現(xiàn)富含TA序列，以免影響mRNA的穩(wěn)定性[13]。

由表3可知，枯草芽孢桿菌蛋白酶編碼鏈核酸基因存在一定的密碼子偏性，CCT（P）、AAA（K）、ACA（T）、GGC（G）、ATT（I）、CTT（L）、AAC（N）、CAA（Q）、AGC（S）、GTA（V）等密碼子優(yōu)勢(shì)明顯可進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)。

表3 枯草桿菌蛋白酶編碼基因的優(yōu)勢(shì)密碼子Tab.3 Dominant codon of subtilisin coding gene

3 結(jié)語(yǔ)

密碼子使用偏好性研究可應(yīng)用在多個(gè)方面，如進(jìn)行基因定位，提高異源基因表達(dá)，預(yù)測(cè)進(jìn)化過(guò)程等[22]。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌蛋白酶基因密碼子第3位GC含量40.22%，比例偏低，說(shuō)明密碼子第3位以A、T為主；Nc值為42.677，CAI值為0.647，處于中等偏性，說(shuō)明密碼子偏性不強(qiáng)，有較多的密碼，需要進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)；相對(duì)同義密碼子使用度分析發(fā)現(xiàn)，CCT（P）、AAA（K）、ACA（T）、GGC（G）、ATT（I）、CTT（L）、AAC（N）、CAA（Q）、AGC（S）、GTA（V）等為優(yōu)勢(shì)密碼子，表明該基因表達(dá)水平有明顯的提升空間。