航天黃花菜組織培養繁殖技術研究＊

帥娜娜，穆妮妮，張秀麗，黃衛紅，任麗娟，頡敏昌△

（1.甘肅省慶陽市農業科學研究院，甘肅 慶陽 745000；2.慶陽市西峰區農業行政綜合執法大隊，甘肅 慶陽 745000）

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）屬百合科（liliaceae）萱草屬，別名萱草、忘憂草、金針菜、健腦草、安神菜等，是一種常見的多年生草本植物[1]，在我國已有2000 多年的栽培史，自古以來就是一種美食。黃花菜花蕾呈細長條狀，黃色，有芳香氣味，具有藥食同源的功能[2]，不僅含有豐富的蛋白質、糖類、多種維生素、游離氨基酸、黃酮類物質和鈣、磷、鐵、鋅、硒等礦物質元素[3]，還具有清熱解毒、抗菌消炎、安神補腦、抵抗抑郁、延緩衰老及抗癌抑癌等功效[4]。

黃花菜在我國栽培歷史悠久，種質資源豐富，南北各地均有栽植，多分布于中國秦嶺以南、甘肅、湖南、江蘇、浙江、湖北、江西、四川、陜西、吉林、廣東與內蒙古草原等地。慶陽地處黃花菜優生區的核心區，是全球品質最好、面積最大、栽培歷史最悠久的黃花菜產區。慶陽黃花菜不僅菜條肥大，色澤黃亮，而且還具有肉質厚嫩，久煮不爛的特點。被列為國家農產品地理標志保護產品。

航天誘變育種是將空間技術與常規農業育種相結合，利用空間的特殊環境，使種子或其他植物體產生遺傳變異，返回地面種植，獲得有益突變體，選育新品種的植物育種技術[5]。我國的航天育種走在世界前列，在農作物育種方面已取得了重要的成果，至目前已通過國家、省級審定或鑒定的品種有200 多個。黃花菜的航天育種起步較晚，發展相對落后，現在還未見成熟報道。

2019 年6 月-2020 年7 月，采用組織培養法擴繁航天黃花菜新品種金蕾二號種苗，試驗對金蕾二號外植體采集、消毒，繼代培養基、生根培養基配方，培養基滅菌，接種，煉苗，移栽大田等環節做了研究，現將結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

本試驗于2019 年6 月-2020 年7 月在慶陽市農業科學研究院組培室進行。

1.2 試驗材料

慶陽市農業科學研究院自主選育的航天黃花菜新品種金蕾二號。

1.3 試驗儀器

生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司生產，型號：HFsafe-1200LC）、全自動立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司生產，100 L）、接種器械滅菌器（濟南格艾特儀器設備有限公司）、紫外線燈、酒精燈。

1.4 試驗方法

1.4.1 外植體消毒

1）幼蕾花絲：將采集的金蕾二號幼小花蕾（長度6 cm 以下），用流水沖凈晾干，在無菌條件下，用70%乙醇浸10～20 s，超純水沖洗3 次，晾干，再用0.1%氯化汞浸8～10 min，超純水沖洗7 次，用滅菌濾紙吸干水分，撕開花瓣，取出花絲，用無菌剪刀將其剪成長約0.5 cm 的小段。

2）根狀莖：將新挖的金蕾二號植株置于自來水下，小水沖洗2～3 h，用毛刷輕輕刷洗葉片及根系間的泥土，洗凈后除去根系，剝離外層葉片，保留根狀莖上部3～4 cm，晾干。在無菌條件下，用70%酒精浸30 s，超純水沖洗3 次，再用0.1%升汞加0.02%吐溫溶液浸泡5 min，超純水沖洗7 次，滅菌濾紙吸干水分，手術刀剝去剩余葉片，切取莖尖0.2～0.5 cm。

1.4.2 誘導培養及外植體的選擇

將黃花菜幼蕾花絲和根狀莖分別接種在誘導培養基上，經過40 d 的培養，統計不同外植體誘導分化情況，選擇最佳外植體。誘導培養基為MS+6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，pH5.8～6.0，培養條件為溫度25 ℃～28 ℃，光照度2000～2500 lx，光照時間16h。

1.4.3 繼代培養

將誘導培養產生的愈傷組織，分割成0.6～1.5 cm 的小塊，接入繼代培養基中進行增殖培養。繼代培養基1 為MS 培養基粉（不含糖和瓊脂）4.74 g+瓊脂5.5 g/L+6－BA 4.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖3%；繼代培養基2 為MS 培養基粉（不含糖和瓊脂）4.74 g+瓊脂5.5 g/L+6－BA 0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+蔗糖3%。每瓶接種4 個單芽，重復3 次。培養溫度25 ℃～28 ℃，光照度2000～2500 lx，光照時間16 h。經過30 d 的培養，隨機選出30 瓶統計愈傷組織、芽叢、無根苗（高3cm、6 片葉以上）增殖情況。

1.4.4 生根培養

金蕾二號繼代培養生成的無根苗高約3 cm，葉6 片以上時，接入不同激素的1/2MS 生根培養基，生根培養基1 為1/2MS 培養基粉（不含糖和瓊脂）2.47 g+瓊脂5.5 g/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖3%，生根培養基2 為1/2MS 培養基粉（不含糖和瓊脂）2.47 g+瓊脂5.5 g/L+IBA0.2 mg/L+蔗糖3%。培養溫度25～28℃，光照度2000～2500 lx，光照時間16 h。經過30 d的培養，觀察生根情況。

1.4.5 煉苗

無根苗在生根培養基上生根2 條以上時，使生根苗逐步接受自然光照、與外界交換空氣、適應較低濕度的環境，直至具備在自然環境中生存的能力，煉苗完成。

組培苗經過30d 煉苗，高度達到10cm 以上，根狀莖直徑0.6 cm 以上，肉質根2 條以上，生長健壯，定植大田。大田等行栽植，行距0.85m，株距0.40 m。

2 結果與分析

2.1 外植體的選擇

經過40 d 的誘導培養，不同外植體誘導頻率統計見表1。據結果可以看出，花絲、根狀莖尖兩類外植體接入誘導培養基中均可誘導產生愈傷組織，金蕾二號幼蕾的花絲接入誘導培養基，7 d 花絲膨大，萌動3 個，15 d 有31 個花絲基部長出黃色愈傷組織，40 d 愈傷組織達到46 個，逐漸變綠分化增多，進入高峰，誘導愈傷率為76.67%；根狀莖尖作為外植體接入誘導培養基，7 d 根狀莖尖膨大，萌動1個，15d 有19 個根狀莖尖基部長出黃色愈傷組織，40d 愈傷組織變綠分化增多，達到28 個，同時長出許多新生芽點，誘導愈傷率為46.67%。綜上，可選黃花菜幼蕾花絲為最佳外植體。

表1 外植體誘導頻率統計表

2.2 繼代培養

選取繼代培養的黃花菜無菌苗，接種于含不同濃度6－BA、NAA、IBA 的培養基中，增值情況見表2。結果表明，20 d 繼代培養基1、繼代培養基2 都能產生大量淡綠色外觀呈不規則的顆粒狀胚性愈傷組織，繼代培養基1 愈傷組織增殖快，30 d 愈傷組織增殖3.1 倍。繼代培養基2 萌發芽叢41 個，生成無根苗23 個。繼代培養基1 適合金蕾二號愈傷組織增殖培養，繼代培養基2 適合金蕾二號分化胚性愈傷組織，生成芽叢，長出無根苗。試驗中還觀察到，金蕾二號花絲誘導愈傷過程中，初次出現的愈傷組織越緊實，表面有小顆粒狀分布的，則增殖及生成芽叢的能力就越強，而誘導的愈傷組織越松散則再生能力越差。

表2 繼代培養基愈傷組織增殖統計表

2.3 生根培養

采用添加NAA、IBA 兩種不同激素的生根培養基，生根情況見表3。結果表明，生根培養基1 接種18 d 從無根苗的根狀莖上萌發出白色乳狀凸起4個，30 d 有113 個苗生根，共生根267 條，無根苗生根率75.33%。生根培養基2 接種18 d 從無根苗的根狀莖上萌發出白色乳狀凸起1 個，30 d 有99 個苗生根，共生根299 條。兩種生根培養基都能促進生根，生根培養基1 培養的植株葉片寬大、苗較健壯，生根快；生根培養基2 生根數較多、根較粗長、根系發達。30 d 后，根數繼續增加，根系繼續擴大。當無根苗生根2～3 條以上時，植株葉片增多，根部肥大，植株生長旺盛，開始煉苗。

表3 生根培養基生根統計表

2.4 煉苗

（1）使用80%多菌靈300～500 倍液均勻噴霧處理寧夏中青生物科技有限公司生產的育苗基質，加水濕透至育苗基質手握成團，捏不出水分，裝入直徑10cm 的營養缽，每缽栽入1 株2 條根系以上，植株葉片寬大、生長健壯的組培苗，立即放入小拱棚，保持溫度25～28℃、相對濕度55%～80%，逐步接受陽光照射。栽入155 株帶根組培苗進行煉苗，11d 后將組培苗移出小拱棚時，死亡76 株，存活79 株。日光溫室內整好練苗用地，開溝，鋪放處理的育苗基質，栽入苗子，沿苗子兩側撒入處理過的育苗基質，壓實，輕澆薄水。7 d 內及時補水。10d 后全部死亡。

（2）日光溫室內開溝，鋪放用80%多菌靈300～500 倍液處理的育苗基質，將130 株2 條根系以上，葉片寬大、生長健壯的組培苗，從培養瓶移出，沖去根部培養基基質，栽入育苗基質之上，沿苗子兩側撒入處理過的育苗基質，壓實，輕澆薄水，加蓋遮陽網。移栽7d 內及時補水，保持小環境具有較高的空氣濕度，減少葉面的水分蒸發，當外圍老葉枯死，新葉長出后，逐漸降低濕度，減少噴水次數，10d 后僅存活1 株，存活率不足1%。

（3）將生根2 條以上的生根苗，連同培養瓶置于自然光照環境，第1 天接受自然光照1h,以后每天增加20 min,逐步適應自然光，7d 后解開封口繩，再過2 d，將封口膜上移，使瓶內組培苗能與外界進行空氣交換，適應較低濕度的環境，7d 后將封口膜去掉，張開瓶口，置于日光下10 d，煉苗完成，移栽大田。大田挖小坑，噴施80%多菌靈300～500 倍液，進行土壤消毒，栽入苗子，沿苗子兩側撒入處理過的育苗基質，壓實，輕澆薄水，加蓋遮掩網遮光，視土壤墑情及時用噴霧器補水。栽植7d 后去掉遮掩網，噴灑0.1%尿素水溶液1 次、噴霧80%多菌靈300～500 倍液1 次，然后每10d 噴1 次。栽植生根苗2216 株，成活1319 株，成活率在59.52%。

（4）將組培苗生根2 條以上的培養瓶，解開封口繩置于培養室，2d 后將封口膜上移，7 d 后將封口膜去掉，張開瓶口，組培苗能與外界交換空氣，適應較低濕度的環境，10d 后使用80%多菌靈300～500倍液均勻噴霧處理育苗基質，加水濕透至育苗基質手握成團，捏不出水分，裝入6cm×6cm32 孔或4.5cm×4.5cm50 孔育苗盤，在培養室經過10d 過渡，期間，死亡13 株，10d 后將育苗盤移入自然光照環境，第1d 接受自然光照1h，以后每天增加20 min，逐步適應自然光照和有菌環境，7d 后，又死亡27株，煉苗期間共死亡40 株，死亡率48.78%。存活42株移栽大田。大田挖小坑，噴施80%多菌靈300～500倍液，進行土壤消毒，栽入苗子，壅土壓實。輕澆薄水，視土壤墑情及時用噴霧器補水。栽植7 d 后噴灑加入0.1%尿素的水溶液1 次、噴霧80%多菌靈300～500 倍液1 次，然后每10 天噴1 次，10d 后，成活19 株。成活率23.17%。

由表4 可以看出，金蕾二號煉苗成活率低，馴化難度大。采用方法（3）煉苗成活率相對較高，但也只有59.52%。航天黃花菜組培苗與傳統品種黃花菜品種組培苗相比生長勢較弱，更容易死亡。

表4 煉苗成活率統計表

2.5 大田區域試驗示范

在位于合水縣固城鎮高臺村合水縣鑫慶豐黃花菜農民專業合作社基地栽植金蕾二號組培苗試驗示范田1330 m2。試驗用苗經過大田生長50 d 以上，根狀莖直徑0.8 cm 以上，肉質根3 條以上，生長健壯。栽植時將地上葉片剪短至3～5 cm，行距0.85m，株距0.40 m。共栽植3900 株，成活3889 株，成活率99.71%。經過煉苗存活下來的金蕾二號組培苗，栽植大田后抵抗力提高，與其他黃花菜品種無差異。

3 討論與結果

1）金蕾二號組培苗再生系統的生長周期明顯，花絲接入誘導培養基經過萌動膨大，誘導出黃色愈傷組織，繼代增殖培養形成芽叢，長出無根苗，無根苗在生根培養基中萌發出根系。不同煉苗方法成活率差異很大，需要進一步探索。

2）本研究結果表明，金蕾二號通過反復繼代增殖培養，可達到大量繁殖的目的。黃花菜以花絲為外植體進行組培快繁，可采用誘導培養基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L、繼代培養基MS 培養基粉（不含糖和瓊脂）4.74g+瓊脂5.5g/L+6-BA 4.0mg/L+NAA0.1mg/L+3%和MS 培養基粉（不含糖和瓊脂）4.74g+瓊脂5.5g/L+6-BA 0.5mg/L+IBA0.2mg/L+3%蔗糖；生根培養基1/2MS 培養基粉（不含糖和瓊脂）2.47g+瓊脂5.5g/L+NAA0.2mg/L 或1/2MS 培養基粉（不含糖和瓊脂）2.47g+瓊脂5.5g/L+IBA0.2mg/L 的組織培養再生系統。

3）金蕾二號黃花菜組培苗生長勢弱，煉苗難度大，成活率低。金蕾二號煉苗中存活的組培苗，抵抗能力不斷提高，移栽到大田后與其他黃花菜品種無差異。