培養基組分對藍莓組培芽的誘導及增殖效率的比較研究

楊 俐 趙素萍

（云南省大理市植保植檢站,云南 大理 671000）

藍莓(Blueberry)又名越橘，杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬（Vaccinium）植物，為多年生落葉或常綠灌木類果樹。藍莓野生種在我國廣泛分布，常見于海拔400-1400m的山林或灌木叢中，是酸性紅埌土的指示植物。大理周圍山林地也有分布，但品質與引進的栽培品種相比較差，無市場價值。藍莓果實中含有豐富的鞣花酸和花青素類物質，以及具有低糖，低脂肪和強抗氧化能力等特點，是聯合國糧農組織重點推薦的人類五大健康食品之一，被譽為世界水果之王。是最近幾年世界發展最為迅速的集營養保健于一身的第三代果樹新品種。目前植物組織培養以及扦插技術廣泛應用于藍莓的繁殖栽培。近三十多年來世界各國在藍莓組織培養的技術上已有深入的進展。我國劉慶忠等在藍莓組織培養工作中最早開展研究工作，取得了很好的成績。吉林農業大學于1983年率先在我國開展了藍莓引種栽培工作，另外山東果樹所，南京農科院，大連理工大學先后從國外引進二百多個品種，同時開展了藍莓繁育技術的研究。目前組織培養快速繁殖技術已成為各地藍莓苗繁育的主要途徑，各地使用的培養基配方也很多，技術效果各不相同。我們采用了目前我國通用的WPM改良配方，同時自己也設計了WM配方，并對兩者進行了比較研究。

1.材料和方法

1.1 外植體

試驗用藍莓品種由大理市藍莓種植合作社提供。分為休眠枝與萌發枝兩種類型。休眠枝來自2012年冬季11.12月及2013年2月。萌發枝來自2013年3-8月。以高灌品種密斯提(Misty)(薄霧)為主，夏普藍(Sharpblue)及兔眼品種燦爛(Bright well)為輔為對比。在田間選取一年生健壯枝條帶回實驗室。切除葉片和頂部花芽，留取下部約10個腋芽的莖段作為外植體。在流水下洗去灰塵后浸泡在含有洗衣粉的水中清洗二次，然后流水沖洗1h。控干水分后置超凈工作臺中，先用較干的75%酒精棉球擦去表面水分，用無菌剪刀剪成5cm段置無菌燒杯內，加入75%酒精浸1min，無菌水沖洗一次，加入0.1%升汞10mim，水洗5次，切成0.5-1cm小莖段，每段帶1個腋芽接種。用50ml三角瓶，每瓶接1個莖段，也有用培養瓶接3個莖段。25℃±2℃2000lx16h/d。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基及激素配比

本實驗所用培養基有二種。一是通用的WPM改良培養基，另一種是自己設計的WM培養基。分別稱為A(WPM)及B(WM)培養基。休眠芽初代分化培養激素配比設六個組合，A、B兩種培養基相同。繼代增殖培養設三種組合，A、B相同。萌發枝初代分化培養只用B培養基，設六個組合。繼代增殖培養也只用B培養基設四個組合。壯苗培養基為B+ZT0.1+IBA0.1mg/L；在生根培養前也可經由B+ZT0.5+IBA0.1mg/L繼代苗轉入。生根培養為三個組合。

1.2.2 休眠芽的初始分化培養

表1 同一培養基不同激素配比對幼苗分化的比較，品種：薄霧(misty)，培養天數50天。

B2.3 0 2 0 0.1 30 13 43.3有愈傷組織

由表一可以看出，休眠芽萌發率普遍不高。最高者為43%（B2.3），最低著26.6%（A1.2、A1.3、B1.2）。在各激素對比中，ZT2mg/L萌發率最高43.3%及40%，ZT1+BA1mg/L和ZT1mg/L，次之(36.6%和33.3%)，而BA較低(33.3%，30%及26.6%)。但是萌發率最高的ZT2mg/L有少量愈傷組織產生，多在莖段基部。如果以葉片為外植體，在葉片切口處及葉柄斷口處產生許多綠色愈傷組織。就A與B兩培養基相比，B培養基的幼苗葉色較綠，葉片也較寬。

表二 不同品種之間在初始培養中分化率的比較，培養天數50天品種：夏普藍(Sha rpblue)、薄霧(misty)及兔眼(Brightwell)

以上三個品種通過比較,以2號品種薄霧的萌發率較高，夏普藍居中，燦爛較低。

1.2.3 休眠芽幼芽的繼代增殖培養

表三 薄霧在不同激素配比的繼代培養中增值效果的比較，培養天數50天

通過二種激素含量對比，50天培養后，平均增殖幼苗數分別為5.5個和6.1個。苗高度最高7.2cm，平均4.5cm與4.3cm。增殖率5倍以上。但ZT2mg/L的幼苗葉片較小，葉色發紅，可能是與非極性物質及色素大分子的積累有關。ZT2mg/L在莖段基部有時會有少量愈傷組織產生。通過降低ZT含量(下降至0.1mg/L)并加入1g/L活性炭可使其恢復正常生長。

1.2.4 萌發枝的初始分化培養

經過第一階段對休眠枝初始分化及繼代培養的觀察比較，在萌發枝的組織培養中選用薄霧品種為研究對象，進一步的比較觀察，為今后大批量生產提供參考依據。

表四 相同培養基（A及B）中，不同激素對初始分化效果的比較，品種：薄霧、培養天數30天

通過上表可以看出，萌發枝經過培養后，幼芽萌發率比休眠芽明顯提高，最高可達80%分，最低也達56.6%，B2.3的ZT含量2mg/L，雖然萌發率高(80%)，但有些莖段基部會產生愈傷組織，而B2.2萌發率僅次于B2.3，基本不產生愈傷組織，而ZT用量減少了一半(ZT1mg/L)。經過對A及B兩種培養基的生長情況比較，B培養基葉較寬大，葉色也較綠，為下步繼代培養提供了參考。

1.2.5 萌發枝的繼代增殖培養

表五 B培養基，不同激素配比對薄霧增殖效果的比較，培養天數50天

通過以上激素對比，可以看到B2.2效果最好，幼苗分枝數、高度、葉色均較好，而TDZ組合，以TDZ0.02mg/L較合適，TDZ0.05mg/L幼苗基部生長較多愈傷組織，苗也不高，分枝也較少。

值得注意的是本次實驗結果的增殖率不高。原因是在5月底、6-7月大理天氣炎熱，培養室無制冷空調，室溫常達28℃以上，最高31℃，使幼苗生長受到抑制，葉色開始變淡，甚至發黃。8月下旬起，氣溫逐漸下降，生長有所恢復，至9月后室溫在27℃以下，生長才轉入正常。整體看，與其他作物相比，增殖率不高，苗也不高，效果不理想。

1.2.6 生根培養

對休眠枝和萌發枝的繼代幼苗進行了生根培養，幼苗來自不同細胞分裂素含量，其生根效果不同。

表六 由繼代培養轉入生根培養時不同細胞分裂素含量對生根效果的比較，品種：薄霧、培養時間50天生根培養基：1/2 B+IBA0.6mg/L+活性炭1g/L

由上表可以看出，從繼代培養轉入生根培養時，必須減少細胞分裂素的含量，否則不生根，只有莖的基部略膨大，有少量根原基產生。如通過壯苗培養，生根效果較好，在壯苗培養基中ZT為0.1mg/L含量很低，苗生長慢，比ZT0.5mg/L要差些，但生根效果比ZT0.5mg/L要好。

在生根培養基篩選方面，做了三個組合，結果如下：

表七 不同生長素含量對薄霧生根率的比較，培養時間50天

通過生長素含量對比，以IBA0.6mg/L較為合適。IBA濃度為1mg/L時，根少而粗短，含量低，則根纖細而多。

1.2.7 瓶外生根

材料選自經過壯苗培養或生根培養未生根的幼苗。將幼苗取出，在水中(加入800倍多菌靈)洗去培養基，在生根液中浸蘸。使用兩種濃度，一種是NAA1000mg+IBA1000mg/L，這種濃度采用速蘸一下；另一種IBA100mg/L浸泡30min。所用基質為消毒后的水苔經800倍多菌靈浸泡12h，然后擠干水分后平鋪在塑料筐內，厚7cm。將小苗用鑷子扦插在苔蘚苗床上。扦插后外邊罩上一層塑料農膜保濕。7天內保濕度95%，20-28℃，放在培養室背光處(防陽光直射)；第二周保濕度85%；20天后逐漸揭去薄膜增加透氣。生根后每周噴1/2大量元素與0.1%Feso4交換噴施，逐漸改成0.2%硫酸銨及0.2%Feso4二周澆施一次。90天后可移栽至直徑15cm的營養缽內，基質為草炭土+松針腐葉土+沙壤紅土(1:1:1)。

2.討論

2.1 藍莓休眠芽的初代培養與萌動芽相比，萌發率偏低。如通過一段室內水培過程，可以提高芽的萌發率。具體做法是將休眠枝條按常規清洗好后，浸入稀新潔爾滅液中15min，蒸餾水洗二次。然后插入蒸餾水中深約3-5cm。在培養室全光照，25℃，每天換水，使休眠芽萌動后再消毒接種。

2.2 藍莓培養過程中，污染現象嚴重，初次消毒曾增加生汞含量為0.15%，消毒10min，或升汞0.1%增加消毒時間為15min。這兩種方法對芽的傷害較大，影響發芽率。另一方面，在培養30天以后，有不少培養瓶內莖段基部出現細菌性污染，真菌性較少。這些細菌是否為莖內已存在的內生菌，也不清楚。我們在培養基中加入青霉素，結晶紫，效果不明顯。

2.3 在培養過程中，幼苗葉片產生紅或紫紅色，或葉色變淡，發黃，發白，甚至玻璃化等現象。這些情況多發生在培養室內溫度超過28℃，瓶蓋為塑料蓋，瓶內透氣不良，出現水漬狀，光照不足等。經過室內溫度調整，改用透氣膜瓶蓋，對培養基組分含量進行調整，保證16h/d光照，加入0.5-1g/L活性炭等措施，這些情況有所改善。

2.4 在藍莓初代分化培養及繼代培養中，均使用不同含量和種類的細胞分裂素，進行比較。我們認為ZT效果比BA略好一些，但ZT價格昂貴，使用量也大，而BA價格低廉，且耐高壓消毒，幼苗的質量也好，所以用BA代替ZT完全可以完成初代分化及繼代增殖的培養，可以大大降低成本。我們也使用了TDZ代替ZT，使用濃度為0.02mg/L，是ZT含量的50-100分之一。雖然TDZ價格貴，但因使用濃度極低，其成本價與BA相近。而且培養的幼苗生長狀況也較好。所以TDZ也是代替ZT的理想細胞分裂素。

2.5 作者自己設計了WM培養基，在藍莓的初代，繼代培養中表現出幼苗葉片比WPM改良培養基略寬大，葉色也較綠，效果勝似WPM。