HPV E6/E7 mRNA陽性而陰道鏡檢查陰性患者中漏診HSIL及以上病變的危險因素分析*

羅燕艷，羅小婉，符麗華，尚雪，林鈺葉

（中山市博愛醫院 婦科，廣東 中山 528403）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。宮頸癌是可以通過早期篩查，盡可能發現癌前病變而將其阻斷的一種惡性腫瘤。因此，很多研究均致力于如何最大程度漏診宮頸癌前病變。研究表明，高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papilloma virus,HR-HPV）持續感染宮頸細胞后，以整合形式存在于宿主細胞并大量轉錄癌基因E6、E7mRNA 并生成E6、E7 癌蛋白，通過失活p53 和pRb 發揮作用，使細胞的生長周期失控，從而引起真正的子宮頸癌前病變，如：高度鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial Lesions,HSIL）和子宮頸癌。因此，認為E6、E7 mRNA 表達提示病毒癌基因已經轉錄表達，可以用于評估子宮頸癌變的風險與發展趨勢［1］。HAEDICKE等［2］發表的Meta 分析指出HPV E6/E7 mRNA 較HPV DNA 和細胞學能更有效的篩出宮頸病變≥宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）2 級以上的人群，從而降低過度治療，可考慮在初篩中單獨應用。本研究對HPV E6/E7 mRNA初篩陽性患者，進一步進行液基薄層細胞學檢查（thinprep cytologic test,TCT）、HPV 分型檢測、陰道鏡檢查及病理活檢。對其中466 例陰道鏡檢查陰性患者經病理確診為HSIL 及以上的病例進行分析，探討這部分患者漏診HSIL 及以上病變的危險因素，從而最大限度減少漏診HSIL 及以上病例，降低宮頸癌的發生率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018 年9 月至2020 年9 月在中山市參加政府宮頸癌篩查的女性，采集的宮頸分泌物統一送至中山市博愛醫院實驗室檢查，將有完整病歷記錄的HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者共466 例納入研究，年齡35～65 歲，平均（55.50±8.59）歲。納入標準：①具有完整HPV E6/E7 mRNA、液基細胞學，陰道鏡評估，宮頸病理活檢和/或宮頸管搔刮術結果；②既往未行宮頸病變治療史；③無其他腫瘤疾病治療史及免疫缺陷者；④排除妊娠狀態。排除標準：①子宮切除者；②資料不全者。所有陰道鏡檢查及活檢、宮頸管搔刮術均獲得患者知情同意，簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HPV E6/E7 mRNA 方法 所有采集標本用Thinprep 細胞保存液瓶保存，統一在中山市博愛醫院實驗室進行Aptima HPV E6/E7 mRNA PANTHER系統自動檢測平臺進行檢測。按照說明書進行操作。針對14 種高危型HPV 亞型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）進行檢測。結果分析根據分析物信號與閾值比（S/CO）進行判讀，分為HR-HPV（+）及HRHPV（-），當檢測結果無效時，需重新檢測；當檢測結果陽性時，行分型檢測，分為HPV16、18/45、其他型別三組。

1.2.2 宮頸液基薄層細胞學檢測 當HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性時，將保存液中剩余標本使用Thinprep 2000 制片系統制成液基薄層涂片后用95%乙醇固定，巴氏染色。由2 位高年資病理醫師進行閱片。結果按國際癌癥協會推薦TBS 系統（The Bethesda system）（2014）分類標準診斷進行報告，分為：未見上皮內病變或惡性病變（no intraepithelial lesions or malignant lesions,NILM）、意義不明的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined significance,ASC-US）、低度鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL）、HSIL、非典型鱗狀細胞、不除外上皮內高度病變（atypical squamous cells-cannot exclude HSIL,ASC-H）、非典型腺上皮細胞（atypical glandular cells,AGC）和鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）。

1.2.3 陰道鏡檢查 由婦科陰道鏡室專科醫生參照2011 年國際子宮頸病理與陰道鏡聯盟（IFCPC）的陰道鏡術語進行陰道鏡圖像的描述和診斷。充分暴露宮頸后，4%醋酸溶液下未見醋白上皮、異常血管等異常圖像，隨后涂抹5%Lugol 碘液不著色，陰道鏡檢查判讀為陰性。

1.2.4 宮頸活檢和/或宮頸管搔刮 對陰道鏡檢查陰性的患者，在陰道鏡下對宮頸進行隨機活檢，活檢點數為1～4 個。對于Ⅲ型轉化區者加行宮頸管搔刮術（endocervical curettage,ECC）。

1.2.5 病理結果 陰道鏡下活檢的宮頸組織制片后采用蘇木素-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining,HE），由病理科醫生進行閱片，并由1 個高年資病理科醫生進行復核，病理結果分為炎癥、LSIL、HSIL、宮頸癌（包括鱗癌、腺癌）。

1.3 統計學方法

通過SPSS 20.0 進行對數據進行分析，計數資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗；采用二分類Logistic 回歸分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者中檢出HSIL 及以上病例情況

以病理為金標準，466 例HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者中檢出42 例HSIL，檢出率為9.01%（42/466）；腺癌1 例，檢出率為0.21%（1/466）。

2.2 不同TCT 中檢出HSIL 及以上病例情況

所有HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者均利用同一份標本保存液中剩余的標本進行了液基細胞學檢查（TCT）。結果NILM、ASC-US、LSIL、ASC-H、HSIL 分別為80.47%、13.95%、4.29%、0.43%、0.86%。以病理結果為金標準，隨著TCT異常級別的升高（因ASC-H 例數少，不計入分析），HSIL 病例的檢出率呈上升趨勢，不同TCT結果中HSIL 及以上病例的檢出率間的差異有統計學意義（χ2=14.440,P=0.002）。見表1。

表1 不同TCT 中檢出HSIL 及以上病例情況 ［n(%)］

2.3 不同HPV 型別中檢出HSIL 及以上病例情況

HPVE6/E7mRNA 陽性者進一步進行型別檢查，分為16、18/45、其他型別三組，對其病理結果進行分析，結果表明，HPV16 型、18/45 型、其他型別中HSIL 及以上病例中檢出率分別為14.89%（14/94）、8.57%（6/70）、7.62%（23/302），雖然HPV16 型中的檢出率最高，但三組在檢測HSIL 及以上病例中差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同HPV 型別中檢出HSIL 及以上病例情況［n(%)］

2.4 不同年齡階段中檢出HSIL 及以上病例情況

進一步分析年齡是否為影響因素，以5 歲為一年齡階段，結果表明，隨著年齡的增長，組織學HSIL 及以上病例的檢出率呈上升趨勢，且差異有統計學意義（χ2=13.328,P=0.020）。見表3。

表3 不同年齡階段中檢出HSIL 及以上病例情況［n(%)］

2.5 HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素分析

以組織學HSIL 及以上的病理結果為因變量，年齡、HPV 型別、TCT 結果作為自變量，進行二分類Logistic 回歸分析，結果顯示只有年齡是HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素。見表4。

表4 HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素分析

3 討論

目前研究表明，當HR-HPV 一過性或早期感染時，病毒DNA 在細胞核內處于游離狀態，E6/E7 mRNA 不表達或低表達；當HR-HPV 持續感染時，病毒DNA 與宿主基因整合，E6/E7 被激活，E6/E7 mRNA 高水平表達。因此，E6/E7 mRNA 表達水平的高低與病毒宿主基因整合及感染狀態相關聯，在HPV 的致病過程中起著關鍵的樞紐作用。HPV E6/E7 mRNA 在準確性和相關性方面比HPV DNA 和細胞學對病變的指示性更好，顯示了宮頸癌新的篩查前景，有望成為宮頸癌初篩的首選［1］。

對于HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者下一步應該如何評估呢？細胞學、陰道鏡檢查都是臨床常用的方法。本研究466 例HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者中，細胞學HSIL 只有4 例，占0.86%。而細胞學正常者達375 例，占80.47%，而且在細胞學正常的HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者中檢出病理組織學為HSIL 病例29 例，檢出率7.73%。可見，對于HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者單純依靠細胞學分流可能會漏診HSIL 以上病例。雖然陰道鏡檢查可以作為進一步評估是否存在宮頸病變的方法，但只有當陰道鏡下轉化區及病變區域完全可見，才能視為陰道鏡檢查充分，漏診浸潤癌的風險才可能降低。因此存在局限性［3］。SONG 等［4］研究發現，在陰道鏡檢查陰性的細胞學LSIL、HPV 陽性患者中，隨機活檢檢出HSIL 及以上病例占12.5%。S?RBYE 等［5］研究發現，陰道鏡活檢陰性或低度病變的520 例女性在2005～2009 年隨訪期間有124 例（23.8%）發生CIN2+病變。劉麗等［6］研究發現，E6/E7 mRNA 表達陽性的女性，即使陰道鏡檢查結果為陰性，1 年后隨訪發現，E6/E7 mRNA 陽性者CINⅡ+（包括CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌）發生率為11.01%（12/109）。本研究在466 例陰道鏡檢查陰性的HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者中檢出42 例組織學HSIL，檢出率為9.01%（42/466）；腺癌1 例，檢出率為0.21%（1/466）。因此，若以HPV E6/E7 mRNA 作為宮頸癌的初篩，對于陽性結果必須高度重視，即使細胞學、陰道鏡評估均為陰性，仍有一定比率漏診HSIL 甚至是宮頸癌。那么，有哪些是漏診的危險因素呢？

在關于HR-HPV 亞型感染與子宮頸癌及其癌前病變關系的研究上，不少研究發現不同亞型HPV 的致病能力不同。2014 年4 月，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準了HPV 分型檢測可以作為子宮頸癌的初篩手段應用于臨床工作中。馬莉等［7］研究發現，高危型HPV 分型檢測在子宮頸癌及其癌前病變的篩查中具有指導意義，HPV16、52 和58 型感染者發生≥CINⅡ病變的可能性大，HPV18 型雖不是主要HPV 感染亞型，但其與≥子宮頸腺上皮內瘤變（CGIN）Ⅱ病變密切相關。王家建等［8］的研究表明，基于HPV E6、E7 mRNA檢測的方法的Aptima HPV 檢測陽性特別是16 型和HPV 18 型和（或）45 型陽性的婦女發生組織學診斷≥HSIL 病變的可能性大。本研究中，HPV16型、18/45 型、其他型別中組織學HSIL 及以上病例中檢出率分別為14.89%（14/94）、8.57%（6/70）、7.62%（23/302），雖然HPV16 型中的檢出率最高，但三組在檢出HSIL 及以上病例中的差異無統計學意義，Logistic 回歸分析也未能顯示HPV 型別是陰道鏡檢查陰性的HPV E6/E7 mRNA 陽性患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素。分析其原因，可能是E6/E7 mRNA 意味著HPV 病毒DNA 與宿主基因已經發生了整合，因此與型別關系不大有關系。但具體原因及是否是漏診HSIL 的高危因素仍需要進一步深入研究。

在關于年齡的因素研究中，PRUSKI 等［9］研究表明，在50 歲以下的患者中，HR-HPV E6/E7 mRNA 檢測敏感度和特異性隨著年齡的增加而增加。聶小倩等［10］的研究表明，高年齡組HPV E6/E7 mRNA 陽性率高于低年齡組，差異有統計學意義。這提示在不同年齡段，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測可能有不同的臨床診斷價值［11］。曹倩文等［3］對絕經后子宮頸高級別鱗狀上皮內病變診治方式的探討發現，絕經組陰道鏡下子宮頸活檢漏診子宮頸癌的比例高于未絕經組（分別為9.4% 和3.8%）。本研究中，在陰道鏡檢查陰性的所有年齡組中，均發現漏診HSIL 及以上的病例。而且隨著年齡的增加，組織學HSIL 及以上病例的檢出率呈上升趨勢，且差異有統計學意義（χ2=13.328,P=0.020）。Logistic 回歸分析也顯示年齡是HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素［O^R：1.070,95%CI：1.027～1.114（P<0.05）］。分析其原因，可能是年齡越大的女性，尤其是絕經后女性，雌激素水平下降，宮頸上皮變薄，鱗柱交界向頸管內移，陰道鏡下常常表現為Ⅲ型轉化區，很難發現一些微小病灶，而出現漏診。因此對于年齡越大的女性，尤其是絕經后女性，如果HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性，即使陰道鏡檢查陰性，除了要參考TCT 結果外，也可以考慮進行常規活檢，必要時行ECC，以免遺漏HSIL 及以上病例。

綜上所述，對于HPV E6/E7 mRNA 陽性的女性，如果陰道鏡檢查陰性，需要參考TCT 結果并結合年齡因素的影響，必要時行宮頸活檢和/或ECC，以免遺漏HSIL 及以上病例。