基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的甲潑尼龍治療腹膜纖維化作用機制研究*

蔡家駒，戴衛(wèi)波，吳惠妃，葉秋明，蕭俊祺

（廣東省中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

腹膜纖維化（PF）為長期腹膜透析（PD）患者的主要和嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致PD 失敗的主要原因［1］，目前仍缺乏有效的防治措施。甲潑尼龍（MP）屬糖皮質(zhì)激素，具有抑制結(jié)締組織中成纖維細(xì)胞增生及膠原合成的作用，可用于治療以增生為主的慢性炎癥，如肺間質(zhì)纖維化［2］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可借助分子生物學(xué)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息，從組織水平預(yù)測藥物對疾病治療作用的機制［3］。本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過構(gòu)建并分析化學(xué)成分－疾病－作用靶點網(wǎng)絡(luò)，從整體上揭示MP 治療PF 多靶點、多途徑的作用機制，為進(jìn)一步探討MP 治療PF 的療效提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 運用數(shù)據(jù)庫和工具

數(shù) 據(jù) 庫 ：PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／），Swiss Target Prediction （http：／ ／www. swisstargetprediction.ch ／），GeneCards（https：／ ／www.GeneCards.org ／）， OMIM（https：／ ／omim.org ／）， STRING v11.0（http：／ ／String － db.org ／）。工具：Bioconductor（http：／ ／www.Bioconductor.org ／），R v3.6.3 軟 件 （https：／ ／www.r－ project.org ／），Cytoscape v3.7.2 軟件（http：／ ／Cytoscape.org ／）。

1.2 化學(xué)成分作用靶點預(yù)測

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索MP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并以sdf 格式保存其 2D 結(jié)構(gòu)，然后將 sdf 文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中，限定研究物種為人類（Homospiens），查詢MP 的潛在作用靶點信息。

1.3 疾病靶點預(yù)測

以“Peritoneal Fibrosis”作為關(guān)鍵詞，在 GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中分別檢索，查找與PF 相關(guān)的基因，合并相關(guān)數(shù)據(jù)庫，刪除重復(fù)和假陽性基因，獲得PF 的作用靶點信息數(shù)據(jù)集。

1.4 化學(xué)成分－疾病－作用靶點預(yù)測

采用編程軟件R v3.6.3 編寫命令代碼，分別導(dǎo)入1.2 與1.3 項下所得相關(guān)靶點信息文件，并繪制 Venn圖，獲得MP 靶點基因和PF 靶點基因交集文件，用于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析。

1.5 化學(xué)成分－疾病－作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

根據(jù) 1.4 項下的作用靶點預(yù)測結(jié)果，使用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建化學(xué)成分－疾病－作用靶點網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點代表藥物、疾病及作用靶點；邊分別用作連接藥物與作用靶點、疾病與作用靶點，體現(xiàn)化學(xué)成分－疾病－作用靶點間的聯(lián)系。

1.6 蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

利用 STRING v11.0 數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入 MP 和 PF 的共同靶點基因文件，限定研究物種為人類（Homosapiens），搜索獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，并以tsv 格式文件導(dǎo)出。將該文件中node1，node2，Combined score 信息分別導(dǎo)入 Cytoscape v3.7.2 軟件，構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)，然后利用該軟件的插件Network Analyzer 分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，獲取節(jié)點度（degree）、介數(shù)中心性（BC）、緊密中心性（CC）等網(wǎng)絡(luò)信息。

1.7 靶點生物功能注釋分析

Bioconductor 是一個通過應(yīng)用編程軟件R 對高通量基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和解釋的工具。首先加載Bioconducter 的Clusterprofiler 包，然后導(dǎo)入作用靶點的基因數(shù)據(jù)并運行代碼，對化學(xué)成分－疾病－作用靶點網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋，以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，設(shè)定P ＜0.01 為有顯著性，將結(jié)果分別以柱狀圖和氣泡圖形式呈現(xiàn)，并根據(jù)富集因子值分析核心通路的富集程度，展示MP 治療PF 的作用通路。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分靶點預(yù)測結(jié)果

利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫合并重復(fù)數(shù)據(jù)后，共收集到MP 的潛在靶點100 個。其中，核受體占26.7%，分泌蛋白占 20.0%，酶占 13.3%。詳見圖 1。MP占比居前10 位的作用靶點基因見表1。

圖1 MP 潛在靶點分類Fig.1 Classification of potential targets of MP

表1 MP 占比前10 位作用靶點基因Tab.1 Top 10 MP target genes

2.2 PF 靶點預(yù)測結(jié)果

檢索GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫，合并數(shù)據(jù)并剔除重復(fù)靶點后，共獲得2 104 個PF 疾病靶點基因。靶點類型主要為蛋白質(zhì)（Protein Coding）和 RNA 基因（RNA Gene）。按相關(guān)性得分大小列出前10 位靶點基因，詳見表2。

表2 PF 相關(guān)性居前10 位的作用靶點基因Tab.2 Top 10 PF target genes

2.3 化學(xué)成分－疾病－作用靶點預(yù)測結(jié)果

將MP 及PF 各自的作用靶點信息導(dǎo)入編程軟件R，通過繪制Venn 圖，共獲得65 個共同靶點基因（見圖2）。分別為白細(xì)胞介素6（IL－6）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶 3（MAPK3）、絲裂原活化蛋白激酶 14（MAPK14）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），以及TJP1，ALOX12，SOD2，CCNE1，MUC1，RAB7A，HBB，DICER1，NR3C1，AR，ADAM17，GLUL，GPBAR1，SHBG，PGR，CYP19A1，HSD11B2，NOS2，ADORA3，ESR2，PTGS1，CDC25A，PRKCA，MPO，TKT，CA12，CDK1，CREBBP，XIAP，RBP4，MAP3K5，JAK1，MAP2K1，SLC5A1，HLCS，ALPL，GRK2，CNR1，EIF2AK3，JAK2，PTPN11，ERBB2，ERBB4，PARP1，ADK，MAP3K8，SLC18A3，ALOX5，CDK2，KIT，F(xiàn)LT3，PIM1，KDR，MAP2K2，PIK3CA，ALK，ADORA1，OPRM1，TTR。

圖2 65 個共同靶點基因的Venn 圖Fig.2 Venn diagram of 65 common target genes

2.4 化學(xué)成分－疾病－作用靶點網(wǎng)絡(luò)分析

使用 Cytoscape v3.7.2 軟件導(dǎo)入 MP 與 PF 的共同靶點基因，建立化學(xué)成分－疾病－作用靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（見圖 3）。

圖3 化學(xué)成分－疾病－作用靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.3 PPI network diagram of ingredient－disease－target

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

將 MP 與 PF 的共同靶點基因?qū)?STRING v11.0數(shù)據(jù)庫中，獲取一個包含65 個節(jié)點和383 條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖 4）。采用 Cytoscape v3.7.2 軟件分析其拓?fù)湫再|(zhì)，一般認(rèn)為節(jié)點度（degree）值不低于所有節(jié)點度2 倍中位數(shù)的節(jié)點，即對整個網(wǎng)絡(luò)具有重要貢獻(xiàn)意義。65 個共同靶點中，degree 值大于中位數(shù)（degree ＝ 12）2 倍的靶點共有 8 個（見表 3）。

表3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果（degree ＞ 24）Tab.3 Results of PPI network analysis（degree ＞ 24）

圖4 65 個共同靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.4 PPI network diagram of 65 common target

2.6 GO 功能注釋及KEGG 通路富集分析結(jié)果

為進(jìn)一步闡明MP 對PF 的作用機制，利用Bioconductor 輸入代碼，對化學(xué)成分－疾病－作用靶點網(wǎng)絡(luò)中的65 個靶點進(jìn)行GO 功能注釋，結(jié)果共獲得53 個條目，其中具有顯著意義（P ＜ 0.01）的有 19 條。由圖 5 和圖 6 可見，MP 靶點主要富集在 protein serine／threonine kinase activity（GO：0004674），protein tyrosine kinase activity（GO：0004713），phosphatase binding（GO：0019902），transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity（GO：0004714），transmembrane receptor protein kinase activity（GO：0019199），steroid binding（GO：0005496），heme binding（GO：0020037），protein phosphatase binding（GO：0019903），tetrapyrrole binding（GO：0046906），hormone receptor binding（GO：0051427）等生物過程中。此外，通過KEGG 分析富集到MP 與PF 治療靶點相關(guān)的基因通路共 10 條（圖 7 和圖 8），具有顯著意義（P ＜0.01）的有7 條，包括 MAPK signaling pathway（hsa04010），EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance（hsa01521），Rap1 signaling pathway（hsa04015）， Ras signaling pathway（hsa04014），ErbB signaling pathway（hsa04012），Endocrine resistance（hsa01522），Platinum drug resistance（hsa01524）等。

圖5 65 個共同靶點的GO 分析結(jié)果柱狀圖Fig.5 A bar chart of GO enrichment analysis of 65 common targets

圖6 65 個共同靶點的GO 分析結(jié)果氣泡圖Fig.6 A bubble chart of GO enrichment analysis of 65 common targets

圖7 65 個共同靶點的KEGG 通路富集分析結(jié)果柱狀圖Fig.7 A bar chart of KEGG enrichment analysis of 65 common targets

圖8 65 個共同靶點的KEGG 通路富集分析結(jié)果氣泡圖Fig.8 A bubble chart of KEGG enrichment analysis of 65 common targets

3 討論

本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，利用多個在線數(shù)據(jù)庫，收集到100 個不重復(fù)的MP 作用靶點，并預(yù)測到2 104 個不重復(fù)的PF 疾病靶點，通過繪制Venn 圖得到65 個共同靶點基因，并以此構(gòu)建了化學(xué)成分－疾病－作用靶點網(wǎng)絡(luò)，獲得了1 個具有65 個節(jié)點和383 條邊的PPI 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)；網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，在65 個作用靶點中，degree 值大于 24 的靶點有 8 個，包括 IL－6，MAPK3，MAPK1，EGFR，mTOR，MAPK14 等；此外，通過GO 功能注釋和KEGG 富集分析，對65 個共同靶點基因進(jìn)行了分析，并根據(jù) P ＜0.01 確定了 19 條 GO 分析信息及7 條作用通路，如蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、MAPK 信號通路和EGFR 信號通路等。

IL－6 是一種多效性細(xì)胞因子，能刺激細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增生，參與炎性反應(yīng)。IL－6 可由成纖維細(xì)胞、間皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞生成。在PD 過程中，腹腔會局部產(chǎn)生IL－6，且在產(chǎn)生腹膜炎時明顯升高［4－5］。經(jīng)常性炎性反應(yīng)可激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)，使基質(zhì)中的細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致纖維化和慢性炎癥［6］。上皮間質(zhì)分化（EMT）是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，在慢性炎癥和多種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用［7］。研究證實，IL－6通過激活JAK2／STAT3 信號通路，誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞（HPMC）發(fā)生 EMT，最終引起 PF［8］。糖皮質(zhì)激素具有明顯的抗炎作用，可抑制腫瘤壞死因子－α（TNF－α），IL －6，IL －8 等多種炎性細(xì)胞因子生成。因此，MP 可能通過調(diào)控IL－6 起到抑制PF 的作用。

mTOR 是位于磷脂酰肌醇3 激酶 ／絲氨酸激酶（PI3K／AKT）通路下游的一種重要的絲氨酸／蘇氨酸激酶，在細(xì)胞內(nèi)作為功能性亞基參與mTORC1 和mTORC2 2 種復(fù)合體的形成。mTORC1 可被生長因子、氨基酸、氧、能量等激活，通過影響mRNA 翻譯，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸的合成，細(xì)胞自噬等生物過程調(diào)控細(xì)胞的生長代謝［9］。mTORC2 的功能主要體現(xiàn)在細(xì)胞存活、遷移等方面［10］。研究顯示，PI3K －AKT － mTOR 信號通路的異常與多種纖維化性疾病有關(guān)，如肺纖維化［11］、腎臟纖維化［12］等。轉(zhuǎn)化生長因子 β1（TGF － β1）是公認(rèn)的強致纖維化因子。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HPMC 在 TGF － β1的刺激下，mTOR 信號通路活化及纖維化改變，提示mTOR 信號通路也參與到 PF 的發(fā)生、發(fā)展過程中［13］。據(jù)此推測，調(diào)控mTOR 通路可能是MP 治療PF 的一個重要途徑。

根據(jù)KEGG 通路富集分析結(jié)果，MAPK 通路富集基因最多，如PPI 網(wǎng)絡(luò)分析中dgree 值較高的靶點MAPK3（ERK1），MAPK1（ERK2），MAPK14（p38α）均屬 MAPK家族成員。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路主要有細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1／2）、Jun 氨基末端激酶（JNK）和 p38 3 條通路。ERK1 ／2 通路可調(diào)控細(xì)胞的生長和分化，JNK 和p38 通路在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究顯示，ERK1／2 和p38 信號通路均參與了 PF 的發(fā)病過程［14－17］，兩者在 TGF － β1致HPMC 細(xì)胞外基質(zhì)過度表達(dá)中起調(diào)控作用［15－17］。因此，MP 可能通過作用于 MAPK 通路中的 ERK1／2 和 p38信號通路，實現(xiàn)對PF 的調(diào)控。

EGFR 是一種具有酪氨酸激酶活性的受體，受表皮生長因子（EGF）和TNF－α 等配體的激活后，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將有絲分裂的信號從細(xì)胞表面?zhèn)鞯郊?xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化等生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，PD患者的 HPMC 表達(dá) EGFR 及其配體 EGF［18］，EGFR 信號通路的激活參與了 HPMCs 的 EMT 過程［19］，給予 EGFR 阻斷劑后可減少 PF 程度［19－20］。由此推測，MP 可能也通過干擾EGFR 信號通路的激活機制而起到抑制PF 的作用。

綜上所述，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過構(gòu)建化學(xué)成分－疾病－作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)MP 可能具有抗 PF 的作用，其作用機制與 IL －6，mTOR，EGFR，MAPK 通路等相關(guān)。