結腸癌CD66b陽性的腫瘤相關中性粒細胞與臨床病理特征的相關性

劉璇，李文亮

(昆明醫科大學，云南 昆明 650000)

0 引言

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，是全球發病率第3、死亡率第2的惡性腫瘤[1]。結直腸癌的預后與診斷分期緊密相關，Ⅰ期結直腸癌的5年相對生存率為90%，而發生遠處轉移的Ⅳ期結直腸癌5年相對生存率僅為14%[2]。然而，目前對于結直腸癌的復發、轉移并無明確的預測指標。中性粒細胞作為人體抵抗感染的第一道防線，對各種炎癥信號做出反應，對癌癥細胞亦是如此[3]。然而在腫瘤微環境中，中性粒細胞出現一群對腫瘤生長轉移具有促進作用的細胞，稱為腫瘤相關中性粒細胞（tumor-associated neutrophils，TANs）[4]，TANs在腫瘤微環境中對腫瘤的發生、發展起著至關重要的作用[5]。在胃癌中，TANs通過GM-CSF-PD-L1途徑，抑制T細胞的增殖和功能，促進腫瘤的進展[6]。然而在結腸癌中，TANs的存在及意義尚未可知。基于此，本實驗采用免疫組化法對54例結腸癌標本中的CD66b進行檢測，探究結腸癌中CD66b與結腸癌臨床病理特征的關系，進一步分析其與結腸癌預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2019年7月至2020年6月在昆明醫科大學第一附屬醫院腫瘤外科進行手術的患者結腸組織。每例標本均包含結腸癌旁組織、結腸癌組織，所有患者診斷標準均依照TNM分期(UICC/AJCC TNM分期系統（2017 年第 8 版）)結腸癌分類，患者共54例，年齡≤63歲30例，年齡>63歲24例；男30例，女24例；分化程度: 高中分化46例，低分化8例；其中TNMⅠ期 8例，Ⅱ期30例，Ⅲ期12例；Ⅳ期4例；有淋巴結轉移者 14例；有遠處轉移者3例。納入標準: 病理檢查確診為結直腸癌; 患者術前均未行放療、化療、靶向治療；患者臨床資料完整。患者愿意參加本研究。本研究得到醫院倫理委員會批準。排除標準: 結直腸 癌晚期出現心、肝、腎等多器官損傷; 過敏體質、皮膚易出血; 伴急性腸梗阻、穿孔等并發癥;臨床資料缺乏; 妊娠或哺乳期婦女及女性育齡患者。

1.2 主要試劑

兔抗人CD66b單克隆抗體，通用型二步法檢測試劑盒（小鼠/兔）（北京中杉金橋），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋），檸檬酸鹽修復液（北京中杉金橋），PBS緩沖液（自配制）。

1.3 方法

標本均經10%中性福爾馬林固定后，制作成石蠟標本后連續 2~3μm厚切片。63℃過夜烤片，脫蠟、透明，檸檬酸高壓抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，一抗4℃過夜孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精染色，脫水透明后，鏡下觀察。免疫組化染色采用SP法，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 結果判讀

TANs密度：CD66b陽性為可見單個細胞強染色，主要定位于細胞膜及細胞質。計數5個高倍鏡視野（×400）結腸癌組織中浸潤的中性粒細胞數，排除壞死組織、間質組織中染色陽性細胞，及非特異性染色。以所有病例中TANs密度的平均數，作為區分高、低密度腫瘤TANs的指標。

1.5 統計學分析

采用SPSS 21軟件進行統計學處理。樣本率之間比較采用卡方檢驗和Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌中TANs的浸潤情況

在結腸癌旁組織中，CD66b陽性的腫瘤相關中性粒細胞密度低（圖1）；在結腸癌組織中，可見CD66b陽性的腫瘤相關中性粒細胞的大量浸潤（圖2）。

圖1 TANs在結腸癌旁組織的密度低

圖2 TANs在結腸癌組織的密度高

2.2 CD66b陽性的TANs在結腸癌及癌旁組織中的表達情況

CD66b陽性的TANs在結腸癌中高密度率為：63.0%（34/54），在癌旁組織中高密度率為：18.5%（10/54）, 兩組比較差異有統計學意義（χ2=21.222，P<0.05），結腸癌組織內CD66b陽性的TANs密度明顯高于癌旁組織（見表1）。

表1 結腸癌組織與癌旁組織內CD66b的表達

2.3 結腸癌組織內CD66b陽性的TANs與臨床病理特征的關系

比較54例結腸癌組織內CD66b陽性的TANs與臨床病理特征的關系，發現CD66b陽性的TANs高密度率在浸潤深度 T1-T2、T3-T4中分別為：0%（0/8）、72%（33/46），差異均有統計學意義（P=0.000）；CD66b陽性的TANs在淋巴結轉移的結腸癌組織中高密度率明顯高于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義（χ2=8.015P=0.005）；CD66b陽性的 TANs在TNM分期Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ的高密度率分別為：49%（19/39）、93%（14/15），差 異 有 統 計 學 意 義（χ2=9.074，P=0.003）。CD66b陽性的TANs的浸潤密度與TNM分期、浸潤深度及有無淋巴結轉移有關（P<0.05）；而與結腸癌患者的年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、遠處轉移均無關（P>0.05）（見表2）。

表2 TANs密度與結腸癌各臨床參數的關系

3 討論

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著人們飲食習慣的改變，結直腸癌的發病率和死亡率正在逐年上升，盡管手術技術、化學藥物和分子靶向藥物抑制腫瘤的生長和轉移[7]，但至少有三分之一的結直腸癌患者發生肝轉移[8]，所以更重要的是阻斷轉移，明確其轉移和新生血管生成機制，在其通路的相關位點或靶點的阻斷尤為重要。

結腸癌免疫微環境越來越得到重視，免疫微環境的T細胞、巨噬細胞等細胞的作用也被人證實，但是對于TANs的研究仍較少，有研究表明，外周血中性粒細胞計數的增加（即中性粒細胞與淋巴細胞比率（NLR））已顯示與胰腺癌、胃癌和乳腺癌的不良臨床結果有關[9-11]。李等回顧性分析了一組354名患有Ⅰ-Ⅲ期癌癥的CRC患者，并揭示了NLR動態變化與總體生存之間的密切關系[12]；高NLR也被證實可預測肝切除術后肝轉移的預后不良[13]；Dell’Aquila等研究表明，對于接受貝伐單抗加化療的不能切除的轉移性CRC患者，高NLR也是一個不良的預后因素[14]；NLR因其檢測容易，可以作為預后指標。CD66b僅在中性粒細胞上表達，在外周血中，CD66b可作為中性粒細胞的標志物。在許多癌癥中，CD66b陽性的腫瘤相關中性粒細胞與腫瘤進展有關[15]，因此腫瘤組織中CD66b陽性中性粒細胞可以作為觀察TANs的標記。

浸潤結直腸癌組織的TANs在腫瘤微環境中起著重要作用，通過表達精氨酸酶，MMP-9，VEGF和許多趨化因子（包括CCL2，CCL5和CXCL4）來支持腫瘤擴張[16]。一些研究表明中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）可能參與促進腫瘤細胞的浸潤和轉移，NETs可以激活CRC細胞上的toll樣受體9，然后通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號促進細胞生長、遷移和侵襲[17]。在本組實驗中，我們通過石蠟切片和免疫組化染色，通過計算其密度，發現CD66b陽性的TANs的浸潤密度與TNM分期、浸潤深度及有無淋巴結轉移有關（P<0.05）。證實結腸癌患者伴隨著CD66b的高表達與患者的病理特征密切相關，提示CD66b陽性的TANs在乳腺癌的轉移與復發中起重要作用。而TANs在結腸癌的促進腫瘤作用是通過TANs的旁分泌還是NETs作用于腫瘤細胞，將成為本組實驗后續研究的重點。

綜上所述，結腸癌中存在大量的腫瘤相關中性粒細胞的浸潤，且與腫瘤的轉移和復發相關。檢測CD66b陽性TANs的密度有成為預測結腸癌轉移、復發的潛在指標。