HIV抗體酶聯免疫試劑性能驗證

魏小文，付繼紅，歐陽良，屈海琴，周愛華，樊華奔，皮麗，吳蘭，方麗娟

（江西迪安華星醫學檢驗實驗室有限公司，江西 南昌 330000 ）

0 引言

獲得性免疫缺陷綜合征，簡稱艾滋病，是由于人類免疫缺陷病毒感染以后所引起的傳染病。人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體的血清學篩查試驗方法常用的有ELISA、CLIA、免疫滲慮層析試驗等。人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體的實驗室檢測是診斷艾滋病的重要依據，一般使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）作為篩查方法[8]，由于該疾病的特殊性，如何保證患者能有效檢出，主要取決于診斷試劑的性能，所以對HIV酶聯免疫吸附法試劑盒性能情況進行確認。

1 一般資料

依據CNAS-CL02-A004《醫學實驗室質量和能力認可準則在臨床免疫學定性領域的應用說明》的要求，對試劑盒的符合率（采用國家標準血清盤），精密度（包括重復性和中間精密度）、檢出限（采用康徹斯坦的質控品）進行性能驗證試驗[2]

1.1 材料與方法

1.1.1 儀器

安圖酶標儀PHOMO、華科瑞HW209696孔洗板機、生物安全柜BSC-1100ⅡA2-X，以上儀器均由廣州廣電計量檢測股份有限公司進行校準。

1.1.2 試劑

北京萬泰人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒（批號：I20191234）。

1.1.3 質控品

1.1.3.1 室內質控品(濃度: 0.5NCU/mL，北京康徹思坦生物有限公司，批號201912005) ；

1.1.3.2 HIV抗體血清參考盤（批號：201901001，有效期至20210123），HIV抗體血清參考盤陰性10份，陽性10份，共20份。

1.2 方法及判斷標準

1.2.1 陰陽符合率HIV抗體血清參考盤陰性10份，陽性10份，共20份樣本，隨機每4份成一組[1]按下式計算：陰性符合率%=（驗證方法與血清盤一致的陰性結果÷10）×100%。陽性符合率%=（驗證方法與血清盤一致的陽性結果÷10）×100%。待評價方法與血清盤的陰性符合率及陽性符合率均應≥95%，驗證通過。

1.2.2 精密度試驗

1.2.2.1 重復性精密度所選樣本至少有一個在臨界值附近，采用接近臨界原倍質控稀釋3.5倍作為水平一、原倍質控作為水平二兩個濃度水平，兩水平各重復檢測20次，驗證批內重復性，計算S/CO的均值、標準差和變異系數（CV）。要求批內CV<10%，則驗證通過[4-5]。

1.2.2.2 中間性精密度所選樣本至少有一個在臨界值附近，采用接近臨界原倍質控稀釋3.5倍作為水平一、原倍質控作為水平二兩個濃度水平，每天檢測1個批次，2個濃度，每個濃度重復測定2次，連續10天(第1天兩水平重復檢測20次，驗證批內重復性)，計算S/CO的均值、標準差和變異系數（CV）。要求批間CV<15%，則驗證通過[4-5]。

1.3 檢出限

將選擇的康徹思坦標準物質0.5NCU/mL稀釋到略高于臨界值濃度（其S/CO值在cutoff值附近），每個稀釋度每天重復測定4次，連續測定5天，以19次以上結果為陽性，其濃度為檢出限，也即C95濃度。判定標準：LOD（檢出限）=已知原倍陽性質控濃度/稀釋倍數。

2 結果

2.1 陰陽符合率用試劑盒檢測HIV抗體血清參考盤的陰性和陽性樣本，樣品的檢測結果陰陽符合率均為100%，具有可比性。（表1）

表1 北京萬泰酶聯免疫試劑HIV陰陽性符合率（HIV抗體血清參考盤201901001）

2.2 精密度驗證

2.2.1 重復性精密度

檢測濃度為0.5NCU/mL稀釋3.5倍質控和原倍質控的CV%分別為3.97%和3.65%小于廠家試劑盒說明書給的參考值（≤10%），驗證通過。（表2）

表2 北京萬泰HIV試劑盒批內重復性精密度驗證結果

2.2.2 中間性精密度

檢測濃度為0.5NCU/mL稀釋3.5倍質控和原倍質控的CV%為 9.05%和7.21%；CV%小于廠家試劑盒說明書聲明的 15%，驗證通過。（表3）

表3 北京萬泰HIV試劑盒批間中間精密度驗證結果

2.3 檢出限

用生理鹽水將康徹思坦標準物質0.5NCU/mL稀釋為6.5、7、7.25、7.5倍，每個稀釋度每天重復測定4次，連續測定5天，以19次以上結果為陽性，計算每個濃度標本檢測所得S/CO的均值，檢出限，標準品稀釋7倍時的濃度為檢出限，其值為0.07NCU/mL，對應的S/CO均值為1.12。（表4）

表4 北京萬泰酶聯免疫試劑HIV試劑盒檢出限驗證

3 討論

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是HIV主要的篩查方法，試劑盒質量是直接影響實驗結果的主要因素，為盡可能避免漏檢和假陽性結果，在選擇使用試劑之前應該對其性能指標進行驗證評估，從而確定性價比高，質量穩定的試劑。

我們參考CNAS-GL038：2019《免疫定性檢驗程序性能驗證指南》，結合本實驗室實際情況，制定了人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體ELISA定性檢驗方法和程序分析性能驗證方案。

本實驗室對選用的北京萬泰HIV酶聯免疫試劑盒進行陰陽符合率、精密度（重復性和中間精密度）、檢出限進行了驗證。檢測試劑盒的陰陽符合率是評估試劑盒性能和質量的重要指標[6-7]，本實驗室的陰陽符合率是通過對HIV抗體血清參考盤檢測來驗證，陰陽符合率均為100%，驗證通過，保障結果的安全性和準確性。

《WST505-2017定性測定性能評價指南》中指出“評價定性檢測試劑或系統精密度時，應采用濃度接近臨界值的分析物作為檢測材料，不宜采用陰性低值或強陽性樣本來評價定性檢測方法的不精密度”[3]本實驗室重復性精密度檢測CV%分別為 3.97%和3.65%；中間精密度試驗的 CV%為 9.05%和7.21%，均驗證通過。說明試劑盒的穩定性和重復性均較好。

最低檢測限是可檢測出的最低分析物的濃度，所以在試劑正式應用于檢測患者樣本前，確定試劑盒的檢出限是尤為重要的。從檢測結果中可以看到，本實驗室所使用的北京萬泰HIV酶聯免疫試劑盒的檢出限為 0.07NCU/mL。能有效避免假陰性和假陽性。

為了使性能驗證試驗結果可靠，本實驗室在實驗前做了準備很充分：

（1）對實驗室設施及環境進行規劃和整改，達到符合生物學實驗室的技術要求；

（2）試驗所用的儀器均經過校準，各項性能指標合格試驗要求；

（3）承擔性能驗證的操作人員經過崗前培訓，熟悉性能驗證方案及儀器性能，質量控制，操作熟練、規范，并且指定專人操作；

（4）對試驗過程中的質量控制控制點進行監控，密切注意操作人員的加樣量、試劑使用、水浴箱中水溫及水位、孵育時間、洗板效果以及實驗室溫濕度的變化等；

（5）性能驗證過程使用同一批號的試劑盒，且使用質控品進行室內質控控制；

（6）試劑盒、質控品室溫避光充分復溫、復融。

（7）試驗后的數據分析，統計及得出合理結論等。

綜上所述，通過對北京萬泰HIV酶聯免疫試劑盒陰陽符合率、精密度（包括重復性和中間精密度）、檢出限驗證表明，該試劑能夠滿足本實驗室的質量目標，可用于本實驗室HIV抗體初篩檢測。