MiR-145-3p抑制肝癌細胞系Huh-7的腫瘤干細胞特性

胡程郡，劉勝，唐豪佑，馬林，曾新，楊洋，黃孝彬，鄧大煒，李勇，李建水(通信作者*)

（1.川北醫學院附屬醫院 肝膽外二科，四川 南充 610000；2.川北醫學院 肝膽胰腸研究所，四川 南充 610000）

0 引言

據最新發布的《2020年全球癌癥統計》（Global Cancer Statistics 2020）估計，原發性肝癌是導致癌癥相關性死亡的第三大主要原因，每年約造成83萬例死亡病例，同時其也是第六常被診斷的癌癥，據估計2020年約906,000例新發。肝細胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）約占所有原發性肝癌的75%-85%[1]，是最主要的原發性肝臟惡性腫瘤。由于早 期癥狀隱匿，就診率低，且復發率高，加上對化學和放射療法的頑固抗性，HCC被認為是預后最差的癌癥之一[2-4]。HCC在世界范圍內，特別是發展中國家中造成了沉重的醫療和社會負擔，尋找更有效的HCC治療方法，改善HCC患者預后迫在眉睫。

腫瘤干細胞（Cancerstemcell，CSC）是一類干細胞樣腫瘤細胞，具有自我更新和產生非CSC腫瘤細胞群體的特性。自其概念提出至今，大量的研究報道了其在惡性腫瘤中的重要意義。CSC在癌癥的發生，進展，轉移、耐藥性和復發中起著關鍵作用。特異性靶向CSC可能是有潛力的HCC新療法[5-8]。

MicroRNA（miRNA）是一類內源性的單鏈非編碼RNA，其長度一般較短，約為22 nt，在物種間高度保守。其通過與靶mRNA堿基配對對其進行切割或翻譯抑制，從而在轉錄后水平發揮調控作用。不同的miRNA和靶mRNA形成了復雜的調控網絡。研究顯示，miRNA參與了細胞中幾乎所有生物行為的調控[9-13]。

目前，已有多項研究發現miR-145-3p在癌癥（包括肺癌、胃癌、結腸癌和前列腺癌）中被顯著下調，其能充當強有力的抑癌因子和高效的腫瘤檢測標志物[14-18]。然而，其在肝癌中的功能和機制尚未闡明。在我們的研究中，這個問題被重點關注。我們分析了miR-145-3p在肝癌中的表達水平及其生物學功能。結果顯示，同在其他惡性腫瘤中一樣，miR-145-3p是強力的HCC抑制因子，其能顯著抑制HCC細胞系Huh-7的惡性行為和腫瘤干細胞特性。這項研究揭示了HCC腫瘤干細胞調控的新機制，并且可能為HCC治療提供新的療法。

1 材料和方法

1.1 生物信息學分析

使用在線工具UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析了miR-145的表達譜[19]。miR-145表達數據獲取自癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA，https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga），本項研究中共包含了369例原發性肝癌和49例正常肝組織。使用Kaplan-Meier Plotter (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service)分析miR-145同原發性肝癌的預后相關性，數據包含421 例RNA-seq平臺的原發性肝癌患者[20]。

1.2 腫瘤組織標本

收集10對HCC癌及對照肝組織（癌旁組織）。所有標本均來自于2019年1月1日到2019年6月1日期間，在川北醫學院附屬醫院肝膽外二科接受根治性肝癌切除的初治患者。所有腫瘤樣本均在川北醫學院附屬醫院病理科進行了病理切片和免疫組化分析，證實為肝細胞癌。驗證后的HCC和對照組織標本在液氮中保存，用于miR-145-3p檢測。所有患者都簽署了用于研究目的標本采集及使用的知情同意書。標本采集、保存及使用程序已經過川北醫學院附屬醫院醫學倫理委員會的批準。

1.3 細胞培養

人肝癌細胞系Huh-7及永生化肝細胞LO2均購買自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（上海）。細胞培養條件如下：Huh-7細胞使用DMEM培養基（Gibco，美國），加入10% 胎牛血清（BI，以色列）、1% 青霉素及鏈霉素（BI），LO2細胞使用RMPI 1640培養基（Gibco），加入10%胎牛血清、1%青霉素及鏈霉素。所有細胞均在37℃、5% CO2條件下培養在恒溫孵箱（三洋，日本）中。

1.4 細胞轉染

慢病毒載體GV369-miR-145-3p和對照陰性載體（加入無意義序列）由吉凱基因（上海）構建。根據吉凱慢病毒使用手冊推薦的轉染方案對Huh-7細胞進行了慢病毒轉染，常規培養72h后，使用2.5 ug/ml終濃度的嘌呤霉素進行穩轉細胞篩選，經篩選的細胞使用含終濃度1.25ug/ml嘌呤霉素的完全培養基培養以抑制野生型細胞生長。穩轉細胞株使用流式細胞術及qRT-PCR進行了驗證。靶向miR-145-3p的siRNA由擎科生物合成，siRNA轉染使用Lipofectamine? 3000（Invitrogen，美國），按使用說明進行。siRNA轉染后的細胞功能實驗時間均在轉染后10天內。

1.5 RNA提取和qRT-PCR

使用TRIzol（Ambion，美國）分別提取實驗及對照細胞RNA，總RNA在Nanodrop 2000紫外分光光度計上進行濃度測定，再使用 Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCRStarter Kit（銳博，廣州）進行逆轉錄。使用特異性的莖環法引物（使用銳博生物專利技術，由銳博生物設計并合成）分別對miR-145-3p和內參U6進行逆轉錄。逆轉錄條件如下：42℃ 60 min，70℃10min 。實時熒光定量PCR（qPCR）引物由銳博生物設計并合成。使用LightCycler?96 PCR儀（羅氏，瑞士）進行qPCR，反應體系為 20μl，程序如下：（1）預變性：95℃ 10min；（2）擴增（40個循環）：95℃ 2秒，60℃ 20秒，70℃ 10秒；（3）熔解曲線分析：70-95℃。使用2-△△CT法對qPCR結果進行分析，miR-145-3p相對表達量以U6為內參標準化后進行組間對比。

1.6 蛋白質提取和免疫印跡試驗（westernblotting）

使用RIPA蛋白裂解緩沖液（索萊寶，中國）裂解細胞，并加入蛋白酶抑制劑混合物（索萊寶），離心后收集上清液。用BCA蛋白檢測試劑盒（索萊寶）定量蛋白，并通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。針對CD44、CD133、EpCAM和GAPDH的一抗抗體購買自Abcam（英國），辣根過氧化物酶偶聯的二抗抗體購買自索萊寶。熒光條帶使用Fusion電化學發光系統（VILBER，法國）檢測。使用AlphaEaseFC軟件對條帶進行灰度值分析。

1.7 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）增殖試驗

使用帶有Alexa Fluor 647染料的BeyoClick? EdU細胞增殖試劑盒（碧云天，中國）檢測細胞增殖能力，過程如下：將轉入miR-145-3p的Huh-7細胞和對照細胞分別種到6孔板中，每組3孔。培養24h后，加入終濃度10 μmol/L的EdU，繼續培養4h。用4%多聚甲醛（PFA）固定細胞，使用含0.3%Triton X-100的PBS進行穿透后，按使用說明配制每孔0.5mL Click反應混合物，孵育細胞30min。用Hoechst（1:1,000）作為細胞核示蹤劑，染色時間為5min后在暗室中室溫自然風干。使用Leicamicrosystem熒光顯微鏡（Leica，德國）進行成像，每孔隨機檢測3個視野，使用ImageJ軟件計數EdU陽性和Hoechst陽性細胞，最終得出增殖率。

1.8 克隆形成試驗

分別將103個Huh-7-145OE和NC細胞種入6孔板，每組重復3孔，并在完全培養基中培養，期間每4天換液1次。3周后，使用4%PFA固定細胞，0.1%結晶紫染色。將6孔板拍照后，使用ImageJ對每孔克隆集落計數，并計算各組細胞克隆形成率。

1.9 Transwell試驗

使用Transwell?板（康寧，美國）檢測Huh-7細胞的遷移和侵襲能力。用于侵襲能力檢測的transwell小室用Matrigel Matrix（康寧）預孵育2h。每個小室中分別種入5×104（遷移）、105（侵襲）懸浮在無血清培養基中的Huh-7細胞。下室中加入含20%胎牛血清的培養基。在孵箱中培養48h后，輕柔洗去上室中的細胞。穿透至膜下的細胞用4%PFA固定，0.1%結晶紫染色，并在Leicamicrosystem顯微鏡下成像。使用ImageJ對隨機3個視野的細胞進行計數，計算平均每視野細胞數。

1.10 流式細胞術

使用分別與APC和PE染料偶聯的CD44和CD133抗體（Miltenyi Biotec，德國）來鑒定腫瘤干細胞。細胞經胰酶消化后懸浮在PBS中，同時加入抗CD44和抗CD133的熒光偶聯抗體，孵育30min后，使用NovoCyte流式細胞儀采集并在NovoExpress軟件中進行分析。

1.11 成球試驗

使用成球試驗評估Huh-7細胞的干性。過程如下：細胞經胰酶消化、計數后種植到超低附著培養瓶（Thermo Scientific，美國）中，每瓶104個細胞，每組重復3瓶。成球試驗特異性培養基成分如下：在無血清DMEM/F12培養基中加入10%牛血清白蛋白（索萊寶），5mg/mL胰島素（Gibco），20μng/mL表皮生長因子（EGF，Gibco），20μng/mL堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，Gibco）和 1：50的 B27（Gibco）。細胞在孵箱中培養1周，分別在第5和第7天使用Leicamicrosystem顯微鏡隨機拍攝5個視野，對每視野下的細胞球進行計數，使用ImageJ測量球體直徑。

1.12 統計分析

所有統計數據均使用GraphPad Prism 8.0.2（GraphPad Prism Software，美國）分析。組間數據通過studentt檢驗進行分析。P值小于 0.05、0.01、0.001分別標注為 *、**、***。

2 結果

2.1 MiR-145在HCC中被顯著下調，且低表達的miR-145與更差的預后相關。

已有多項研究證明了miR-145在HCC組織和細胞中表達下調，但其潛在的作用和機制并未被闡明[21-24]。我們使用在線數據庫分析工具UALCAN分析了來自TCGA數據庫的369例HCC和49例正常肝組織標本數據。結果表明，miR-145在HCC組織中被顯著下調（P<0.0001, 圖1a），并且，低水平的miR-145與TP53基因突變相關（P<0.001, 圖1b），這表明miR-145可能是HCC的潛在抑癌因子。

因此，我們收集了10對HCC和癌旁組織，并使用qRTPCR檢測了miR-145-3p的表達。檢測結果與前期生物信息學分析一致，在HCC組織中，miR-145-3p表達明顯低于正常組織（P=0.0253, 圖1c）。

進一步地，我們分析了miR-145同HCC預后的關聯。使用Kaplan-Meier Plotter分析421 例來自TCGA數據庫的RNA-seq平臺HCC患者預后信息。生存曲線顯示，低表達的miR-145與更差的生存顯著相關（P=0.028，圖1d）。

圖1 正常和肝癌組織中miR-145的表達差異以及miR-145同肝癌患者預后的關聯

2.2 MiR-145-3p在Huh-7細胞中低表達，且能顯著抑制Huh-7細胞的惡性行為。

我們檢測了HCC細胞系Huh-7和永生化肝細胞LO2的miR-145-3p表達，發現同LO2相比，Huh-7細胞的miR-145-3p表達顯著下調（P<0.0001，圖2a）。這與上述組織數據以及生信分析結合，提示了miR-145-3p作為HCC抑癌因子的高度可能性。

在Huh-7細胞中，我們使用GV369-miR-145-3p慢病毒上調了miR-145-3p的表達。建立高表達miR-145-3p的Huh-7穩轉株（記為Huh-7-145OE）及其對照轉染細胞（記為 Huh-7-NC）用于后續實驗（P<0.0001，圖2b）。

我們分析了miR-145-3p對Huh-7細胞生物學行為的影響。使用EdU增殖試驗分析Huh-7-145OE和NC細胞的增殖能力，結果表明，高表達miR-145-3p的Huh-7（Huh-7-145OE）細胞,其增殖速度相比轉染了對照慢病毒的細胞（Huh-7-NC）受到顯著抑制（P<0.001，圖2c），同時，克隆形成試驗的結果表明，其克隆形成率也明顯低于對照細胞（P<0.01，圖2d）。Transwell試驗被用于檢測細胞的侵襲和遷移能力。我們觀察到，同NC細胞相比，Huh-7-145OE細胞的侵襲和遷移能力出現了明顯的下降（P<0.01圖2e和2f）。這些結果表明，在轉染了miR-145-3p后，Huh-7細胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力被顯著抑制。

圖2 Huh-7細胞中miR-145的表達及miR-145-3p在Huh-7細胞中的生物學功能

2.3 MiR-145-3p抑制Huh-7細胞的干細胞特性。

腫瘤干細胞已經在包括HCC在內的多種癌癥中被發現和鑒定[25,26]。2018年，zhu等報道了miR-145能抑制結直腸癌的干性15。由于已經發現miR-145-3p能抑制Huh-7細胞的惡性行為，我們進一步分析了其對Huh-7細胞干性的影響。

成球試驗常用于檢測腫瘤細胞的干性。我們發現，在培養了5天和7天后，轉染了miR-145-3p的Huh-7細胞形成的細胞球，其直徑（P<0.01，P<0.05，圖3a）和數量（P<0.05，P<0.05，圖3a）明顯低于Huh-7-NC細胞。結果初步表明，miR-145-3p對Huh-7細胞干性產生了抑制。

CD44和CD133作為HCC的干性標志物已被廣泛認可[27]。我們使用流式細胞術分析了Huh-7細胞表面CD44和CD133的表達情況。同成球的結果一致，在Huh-7-145OE細胞中，CD133+ CD44+ 細胞比例明顯低于Huh-7-NC細胞（P<0.01，圖3b）。這表明miR-145-3p顯著抑制了Huh-7細胞的干細胞特性。

使用蛋白免疫印跡試驗，我們還檢測了Huh-7細胞中HCC干性基因的表達情況。CD44、CD133和EpCAM是被廣泛接受了HCC干性標志物[27]，我們檢測了其蛋白表達情況。結果表明，在轉染了miR-145-3p后，CD44、CD133以及EpCAM的蛋白表達水平都出現了不同程度的下調（P<0.01，圖3c）。

圖3 MiR-145-3p對Huh-7細胞干性的影響

2.4 抑制Huh-7-145OE細胞中的miR-145-3p表達恢復了Huh-7細胞的腫瘤干細胞特性。

在Huh-7-145OE細胞中，我們再次轉染了靶向miR-145-3p的siRNA，抑制了其表達（抑制miR-145-3p組和對照組分別記為si145組和siNC組，P<0.001，圖4a）。我們對轉染了siRNA的Huh-7細胞進行了成球試驗和流式細胞術以分析其腫瘤干細胞特性。結果發現，隨著miR-145-3p的表達再次被抑制，Huh-7細胞的成球能力得到了提升（圖4b），且CD133+ CD44+細胞比例也再次提高（P<0.05，圖4c）。

最后，我們再次檢測了細胞中CD44、CD133和EpCAM的表達。與之前的結果一致，抑制miR-145-3p后，這些干性基因的蛋白表達再次升高（P<0.01，圖4d）。這些結果都表明，miR-145-3p是強有力的HCC抑癌基因，其能顯著抑制HCC細胞系Huh-7的干細胞特性。

圖4 再次抑制miR-145-3p后，Huh-7-145OE細胞干性被恢復

3 討論

由于早期診斷率低、嚴格的手術適應證以及缺乏移植來源，HCC在世界范圍內，尤其是發展中國家中造成了很大的醫療和經濟負擔。加強早期患者篩查和系統治療能會帶來更多的臨床獲益。近年來，美國食品藥品監督管理局推薦了多種系統性藥物，包括酪氨酸激酶抑制劑（索拉非尼，侖伐替尼）和抗PD-1藥物（納武單抗和帕博利珠單抗），作為目前的一線治療藥物，它們的療效顯示出HCC治療中令人鼓舞的進步[28]。然而，HCC仍是癌癥相關死亡的第三大主要原因，反映出目前的治療方法仍有相當程度的不足。

腫瘤干細胞在惡性腫瘤的發生、進展和復發過程中起關鍵作用。隨著CSC研究的深入，越來越多的研究報道了肝細胞癌中干樣腫瘤細胞的存在。HCC中CSC表現出的高增殖潛能、致瘤性、抗凋亡能力，以及自我更新和分化為異質性腫瘤細胞的潛力，顯著加速了腫瘤的進展[29]。有報道指出，高水平的CD133表達與更晚的腫瘤分期、更高級別的分級和復發率、更短的總生存期相關[30]。類似地，EpCAM + AFP+的HCC亞型具有肝干/祖細胞的特征，且EpCAM +HCC細胞與腫瘤的進展和侵襲性相關[31]。靶向CSC的治療是非常有潛力的HCC療法，但受限于復雜的腫瘤微環境、CSC強大的耐藥性以及自我更新能力，這種療法尚未取得顯著的療效[32]。因此，加深CSC調控機制探索，尋找更精確、更有力的治療靶點，是CSC靶向療法未來的發展方向。

MicroRNA研究作為近年來表觀遺傳學和腫瘤研究的熱點，已受到廣泛關注。在本研究中，我們發現了miR-145-3p在HCC中充當抑癌因子，并進一步證明了其對HCC腫瘤干細胞存在顯著的抑制作用。這為HCC的干細胞研究找到了新的潛在的治療方法。盡管如此，miR-145-3p調節Huh-7腫瘤干細胞特性的機制還有待于進一步探索，尋找更多的精確治療靶點。希望有朝一日，特異性靶向腫瘤干細胞的肝癌新療法能為HCC患者帶來更好的臨床獲益。

縮寫詞

HCC,hepatocellular carcinoma，肝細胞癌; CSC, cancer stem cells，腫瘤干細胞; miRNA, microRNA，微小RNA; TCGA, The Cancer Genome Atlas，癌癥基因圖譜;EdU, 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，5-乙炔基-2’ -脫氧尿苷; PFA, paraformaldehyde，多聚甲醛;PBS,phosphate buffer solution，磷酸鹽緩沖液; HRP, horseradish peroxidase辣根過氧化物酶。