補腎活血方干預兔膝骨性關節(jié)炎自噬和凋亡作用的研究

鄧斌，張玉笙，林美專，康書鵬，許鎮(zhèn)文

（廣東省普寧市中醫(yī)醫(yī)院骨科，廣東 普寧 515300）

1 實驗用動物及相關材料

20只普通級3月齡雄性新西蘭兔（湖南太平生物科技有限公司，證號：SYXK（湘）2020-0005；），RIPA細胞裂解液（北京普利萊，C1053）；BCA蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）等試劑。

實驗用中藥配方（廠家：廣東一方制藥有限公司，廣東省普寧市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供）：丹參顆粒劑20g、制附子顆粒劑10g、 熟地顆粒劑20g、 巴戟天顆粒劑15g 及仙茅顆粒劑10g等提取生藥 。

2 實驗方法

2.1 兔子膝關節(jié)炎造模

常規(guī)石膏繃帶固定造模方法，伸直位6w固定兔左后膝關節(jié)，定期檢查石膏，防止松動、脫落，要求DR片證實造模成功。

2.2 動物給藥處理及取樣方法

正常對照組和模型對照組的兔子用等量的生理鹽水灌胃，模型+補腎活血方組的兔子用等量的中藥（7.56mL/kg/d）灌胃，灌胃給藥6w，在灌胃時，管子先插10cm左右，再用管子的另一端伸入準備好的水中，看兔子在呼吸時管子中的水柱是否會跟著呼吸迅速上升或下降，如果不行，拔出重置。也可以在伸入5cm左右先用水驗證，驗證方法同上，再通過回抽驗證，驗證方法為如果注射器中回抽的氣體比較多，且負壓不大，則拔出管子重復之前操作，如果回抽的氣體比較少，且負壓比較大，則可以注入中藥。

取各組兔子左腿膝關節(jié)軟骨，股骨髁部軟骨用于做HE檢測，脛骨上端軟骨各取半分別做WB檢測和PCR檢測。

2.3 HE染色

HE染色常規(guī)步驟逐步處理組織，最后鏡檢。

2.4 qPCR檢測

收集各組兔子膝關節(jié)軟骨組織，用Trizon裂解法提取RNA，經(jīng)濃度測定后，通過逆轉錄得到cDNA，再用基因相應引物和熒光定量試劑盒上樣進行相對表達量測定。檢測所用引物信息見表1。

表1 引物信息總表

2.5 Western Blot檢測

收集三組中兔膝關節(jié)軟骨組織，1）裂解、離心并吸取上清，獲得總蛋白。2）測定蛋白濃度后蛋白變性，上樣。3）凝膠電泳、轉膜。4）一抗、二抗溶液孵育。5）在成像系統(tǒng)中曝光，用“ImageJ”軟件分析各抗體條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均用Graphpad Prism7統(tǒng)計分析，表示為平均值±SD。組間的顯著性差異經(jīng)One-way和Two-way ANOVA分析，以P<0.05作為顯著性差異。

qPCR的數(shù)據(jù)按照2-△△Ct法計算相對表達量，在P<0.05的情況下，如果2-△△Ct小于1，說明目的基因在實驗組中表達下調；大于1說明表達上調；P>0.05則表達無差異。

4 實驗結果

4.1 膝關節(jié)軟骨組織HE染色結果

正常對照組中，鏡下可見光滑的軟骨表面，清晰規(guī)則的四層結構，正常的軟骨細胞數(shù)量，清晰完整的潮線。模型組中鏡下可見不光滑的軟骨表面，而且糜爛和缺損、深達輻射層，簇狀增生明顯的周圍軟骨，軟骨變薄、厚薄不均，細胞數(shù)顯著減少。加入補腎活血方提取的生藥處理后，軟骨表面變光滑，簇狀增生變少。

圖1 膝關節(jié)軟骨組織HE染色結果圖

4.2 qPCR檢測數(shù)據(jù)按照2-△△Ct

法計算所得相對表達量，見表2。

表2 qPCR檢測數(shù)據(jù)按照2-△△Ct 法計算所得相對表達量

4.3 qPCR檢測數(shù)據(jù)按照2-△△Ct

法計算所得相對表達量對比，見表3。

4.4 Beclin-1和 Bcl-2表達情況表

見表4。

表4 Beclin-1和 Bcl-2表達情況表

圖2 膝關節(jié)軟骨組織表達結果統(tǒng)計圖

5 討論

文獻記載骨性關節(jié)炎（OA）發(fā)病機制在于原發(fā)的肝腎虧虛和繼發(fā)的瘀血阻滯，虛和瘀相互影響共同導致OA。中醫(yī)臨床治療中，多數(shù)醫(yī)學專家運用補腎活血的方藥治療，針對OA的內因和外因，標本兼治都取得了良好療效。本研究中所用補腎活血方由丹參顆粒劑20g、制附子顆粒劑10g、 熟地顆粒劑20g、 巴戟天顆粒劑15g 及仙茅顆粒劑10g等提取生藥，其中制附子補腎陽、散寒止痛，巴戟天、仙茅補陽溫腎、祛風除濕，熟地補血養(yǎng)陰，用于肝腎陰虛，丹參活血祛瘀，通經(jīng)止痛，共奏補陽溫腎，活血祛瘀止痛之功。實驗課題也證實：膝關節(jié)炎模型中加入補腎活血方處理后，軟骨表面變光滑，簇狀增生變少，自噬相關基因Beclin-1和自噬蛋白Beclin-1表達降低，抗凋亡基因Bcl-2和抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加。認為該補腎活血方能改善兔膝骨性關節(jié)炎，能影響兔子膝關節(jié)炎自噬相關基因、蛋白和抗凋亡基因、蛋白的表達。

從現(xiàn)代醫(yī)學的角度看，OA的主要病因是軟骨細胞過度凋亡和軟骨細胞外基質的降解。自噬是溶酶體降解損壞蛋白和細胞器的代謝過程，是細胞在應激狀態(tài)下的一種重要的存活機制，自噬可以對OA軟骨細胞發(fā)揮保護作用[1]。細胞的凋亡是軟骨退變的主要機制，防止軟骨細胞的凋亡有利于損傷軟骨的修復。細胞自噬與細胞凋亡的相互作用較復雜,既相互協(xié)同又相互拮抗,細胞凋亡通路的激活或抑制也可能受自噬調控藥物調控的自噬過程有關[2]。Beclin-1被認為是Bcl-2蛋白家族的成員之一[4]，Bcl-2蛋白家族調控自噬的關鍵節(jié)點在于Beclin-l[6],由Beclin-l基因調控的細胞自噬可清除細胞內受損的細胞器和降解的大分子物質，減少積累，維持細胞的穩(wěn)態(tài)，促進軟骨細胞的生存。Bcl-2蛋白家族由抗凋亡和促凋亡分子組成，其主要通過作用于線粒體和內質網(wǎng)來調控凋亡[3,4]，Bcl-2/Bax是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素, 可反映細胞凋亡情況[5]。Beclin-1可與Bcl-2抗凋亡蛋白結合直接調控自噬和凋亡。細胞選擇自噬還是凋亡,主要取決于自噬蛋白Beclin-1還是凋亡效應者Bak/Bax被激活，Beclin-1與Bcl-2/Bcl-XL結合或Beclin-1脫離Bcl-2/Bcl-XL的結合,從而誘導凋亡和自噬功能[4]。Beclin -1/Bcl-2介導的自噬/凋亡互反饋作用，可能是調控自噬與凋亡交互作用的關鍵機制。本研究也表明自噬和凋亡是密切相關的，兩者有共同的誘因，共享一些重要的調節(jié)分子。