噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性的CoMFA模型與分子設計

唐自強，馮 惠，馮長君

(1.徐州工程學院材料與化學工程學院，徐州 221018；2.徐州技師學院，徐州 221151)

1 引 言

噻吩并嘧啶衍生物是一類具有殺菌、抗過敏、除草、抗驚厥和抗癌等良好生物活性的稠雜環化合物，具有較好的臨床開發價值，特別是其抗癌活性引起了人們的重視并展開了相關的研究[1].王紅梅等[2]應用5，6，7，8-四氫苯并噻吩膦亞胺，經氮雜Wittig反應合成了不同取代的新型稠合噻吩并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮衍生物，通過體外抗腫瘤活性測試，顯示這些化合物具有良好的抗腫瘤活性.周新等[3]以1，2，4-三氮唑為起始原料，經Gewald反應、Wittig反應合成了含氟噻吩并嘧啶酮類衍生物，其抑菌活性測試結果表明它們對棉花枯萎菌、水稻紋枯菌、黃瓜灰霉菌、小麥赤霉菌、蘋果輪紋及棉花炭疽具有較好的抑制作用.近年來研究發現，吡啶并嘧啶衍生物如吡啶并[4，3-d]嘧啶化合物也是一類具有良好抗腫瘤活性的雜環化合物，并對多種腫瘤細胞均有較強的抑制作用.這些噻吩并嘧啶、吡啶并嘧啶類雜環化合物不僅能夠抑制多種腫瘤細胞的形成、增殖，而且還可以誘導細胞的凋亡，有望成為新型的抗腫瘤藥物.

基于噻吩并嘧啶、吡啶并嘧啶骨架展現出的優異抗腫瘤活性，王勝紅等[4]應用氮雜Wittig反應合成了25個嘧啶環上具有不同取代基的新型四氫苯并[4'，5']噻吩并3'，2'：5，6]吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物，簡稱“噻吩并嘧啶衍生物”.他們以5-氟尿嘧啶(5-FU)為陽性對照藥，采用MTT法對合成的化合物進行抗胃癌細胞(MGC-803)活性評價.

物質構效關系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)[5-11]是研究化合物分子結構與生物活性之間因果關系，揭示其間量變規律，并利用規律估算與預測活性，以及探討作用機理等.其在預測化合物生物活性方面已成為化學、醫藥、環境等學科的一個重要領域.本文采用比較分子力場分析(comparative molecular field analysis，CoMFA)方法[12-19]研究噻吩并嘧啶衍生物對胃癌的抑制活性(p M)[4]，以揭示影響它們抗腫瘤活性的微觀結構因素，探討其抑制腫瘤作用的分子機理.

2 實驗方法

2.1 數據來源

王勝紅等[4]合成的25種噻吩并嘧啶衍生物的分子基本結構見圖1.其中取代基R1、R2為分子中可變部分，具體分子結構見表1.他們測定抗胃癌細胞的半數抑制濃度以“IC50”表示，單位為μmol·L-1.考慮化學反應自由能變與平衡濃度為對數關系，故令：

圖1 噻吩并嘧啶衍生物分子的基本結構Fig.1 Basic structure of thienopyrimidine derivative molecules

它們的IC50及p M數據見表1.

2.2 建模方法

本文3D-QSAR[17]分析及建立CoMFA模型均使用Tripos公司Sybylx2.1.1分子模擬軟件完成，使用的模塊包括SYBYL、Sketch、Minimize、Database-alignment以及CoMFA的QSAR方法等，各項參數除特別指明外均采用缺省值.

2.2.1 化合物低能構象的確定及分子疊合

分子活性構象的確定是建立有效3D-QSAR模型的前提之一.通常采用分子的最低能量構象代替藥效活性構象.使用Sybylx2.1.1軟件中的Sketch molecule模塊先構建25個噻吩并嘧啶衍生物分子的初始三維結構，再通過Minimize模塊，選取Tripos力場，加Gasteiger-Huckel電荷，將最大迭代次數(Max.Iterations)定為1000，將Gradient降低到0.005；最后將Powell能量梯度法的收斂梯度設為0.21kJ·mol-1·nm-1.對所有分子進行分子力學能量最低優化，通過全構象搜索得到能量最低構象，并以此最低能量構象作為分子疊合的生物活性構象.

隨機選取分子3、9、14、17、21為測試集(Test set；含13號分子.為表1中帶“*”的分子)，余下20個分子作為訓練集(Training set).選取抗胃癌活性最強的13號為模板分子，采用公共骨架的疊合方式(即保證所有分子取向的一致性，使分子間相互重疊時的均方根偏差最小)予以疊合.即以13號分子中的公共骨架，運用Align database模塊分別對訓練集、測試集進行疊合.訓練集的疊合圖見圖2(注：測試集的疊合圖與其非常相似不予列出)：

圖2 訓練集的疊合圖Fig.2 3D view of all the aligned molecules in training set

表1 噻吩并嘧啶衍生物分子結構與抗胃癌活性(p M)Table 1 The molecular structures and anti-gastric cancer activity(p M)of thienopyrimidine derivatives

2.2.2 CoMFA模型的建立

采用Tripos標準力場，對訓練集的疊合分子周圍每個網格點上的立體場(Steric，St)及靜電場(Electrostatic，El)予以計算，以偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)進行建模.采用逐一剔除法(Leave-one-out，LOO)進行交叉驗證，以獲交叉驗證系數Rcv2和最佳主成分數N.一是以Rcv2衡量模型的預測能力，要求Rcv2>0.3的模型，具有95%的可信度[20]，隨機性小于5%.二是模型中的化合物數(m)與變量數(N)之比，即樣變比S v，S v≥5才具有統計意義，和良好的穩健性及較低或然性[21].三是進行回歸分析，得到非交叉驗證判定系數R2、統計方差比F.最后采用View CoMFA模塊，以三維等勢圖直觀反映立體場和靜電場對噻吩并嘧啶衍生物p M的貢獻.

3 結果與討論

3.1 CoM FA模型

訓練集的CoMFA模型：(1)交叉驗證部分：Rcv2=0.397>0.3，N=4，S v=m/N=5，表明模型具有很好的預測能力與穩健性.(2)非交叉驗證部分：R2=0.835>0.8，顯示良好擬合性；R2又稱為削減誤差比例，意為該模型包含影響噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性83.5%的因素，僅有不足16.5%的屬于未知因素.(3)在95%顯著水平下，F臨界值為：F0.05(4，14)=3.11.該模型的F=18.95，是其臨界值的6倍多，表明模型是密切相關，具有統計學穩定性.因此，該模型具有較低的標準偏差SE，僅為0.333.利用訓練集的3D-QSAR模型對測試集中分子的p M進行預測，以檢驗其預測能力.測試集的p M預測值見表1，與相應實驗值基本吻合，其平均誤差只有0.180，表明模型確實具有良好的預測能力.25個化合物的實驗值與估算值(及預測值)的散點圖見圖3，這些散點基本都密集在直線附近，證明該模型具有良好的相關性及預測能力.

圖3 噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性的實驗值與預測值的相關圖Fig.3 Plot of the experimental p M vs.calculated p M of thienopyrimidine derivatives

3.2 CoM FA等勢圖

圖4 給出了以訓練集中抗胃癌活性最高的13號分子為模板建立的CoMFA模型的三維等勢圖，分子周圍不同顏色的塊狀圖表示噻吩并嘧啶衍生物分子中取代基的立體場和靜電場對抗胃癌活性的影響.圖4(a)為立體作用等勢圖，增大取代基體積有利于提高噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性的區域以綠色表示，黃色區域表示減小取代基體積對抗胃癌活性有利.由立體場的空間分布可知，在2個苯環的3、4-位上(較大綠色區域)引入較大體積的基團，有助于提高噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性.如在R1相同下，4-MeO-Ph、-Ph、n-C3H7的體積依次減小，它們的疏水性降低，透過胃癌細胞膜難度增大，進入細胞內濃度減小，與胃癌靶標作用幾率下降，導致p M(實驗值)亦是逐漸降低.

圖4 CoMFA模型的立體場(a)與靜電場(b)等勢圖Fig.4 CoMFA contour maps(a)steric field；(b)electrostatic field

圖4 (b)為化合物周圍的靜電場分布，增大基團正電性有利于抗胃癌活性增強的區域以藍色表示，紅色區域則表示引入帶負電荷的基團對活性有利.由靜電場的空間分布可知，僅有遠離苯環的2、3位之間小塊藍色區域，可以忽略其對抗胃癌活性的影響.而在2個苯環的4-位上都被大片紅色區域覆蓋，說明在這些區域引入負電性基團，有助于提高噻吩并嘧啶衍生物的抗胃癌活性.因此，在R1相同下，4-F、4-MeO、4-Cl的吸電子能力遞降，它們的p M亦是逐減.例如13、12、14的p M為6.105、5.125、4.295，依次減小.

訓練集的3D-QSAR模型給出的立體場和靜電場對p M的貢獻分別為40.9%和59.1%，顯示取代基的立體作用弱于靜電作用.即在R1(或者R2)相同下，p M的主要取決于R2(或者R1)中苯環上取代基的吸電子能力.例如4-MeO、4-Cl、4-F的體積是依次減小，而吸電子能力遞增順序為4-Cl、4-MeO、4-F，因此，它們的p M按此順序漸增.可見，4-F是最大的負電性基團，故其抗胃癌活性最強，此與文獻[4]結果一致.由于靜電作用一般包含庫侖力、氫鍵及配位，立體作用對應疏水性和空間位阻.因此，抗胃癌活性主要源于取代基與胃癌細胞內生物受體之間的庫侖力、氫鍵及配位，其次是疏水性和空間位阻.尚需指出，13號分子的R1、R2均為4-F，其p M高達6.105.比第二強的12號分子(其R1為4-F，R2為4-MeO)高出0.980.而CoMFA模型給出13、12號分子預測值為5.270、5.099，相差僅為0.171.有理由認為此0.980中可能包含均為4-F的強強聯合的附加效應，也可能存在較大的實驗誤差.

3.3 分子設計

QSAR研究目的之一是根據所建模型中隱含的影響生物活性的主要結構信息進行分子設計.由3.2分析可知，在R1、R2中苯環的4-位上引入體積較大的負電性基團，有利于增強噻吩并嘧啶衍生物的抗胃癌活性.據此設計4個化合物(見表1中第26-29號化合物)，3D-QSAR模型給出較大的p M預測值，在5.430-5.844之間，均優于13號分子預測值(5.270).這些理論上優良的抗胃癌化合物，有待生物醫學實驗確認.

4 結 論

(1)采用比較分子力場方法(CoMFA)建立噻吩并嘧啶衍生物的抗胃癌活性的3D-QSAR模型：Rcv2=0.397，S v=5，R2=0.835，F=18.95，顯示良好的穩定性、相關性和預測性.

(2)CoMFA模型三維等勢圖顯示在R1、R2中苯環的4-位上引入體積較大的負電性基團，有利于增強噻吩并嘧啶衍生物的抗胃癌活性.據此設計的4個化合物，具有較大的p M預測值，有待生物醫學實驗確認.