兩株解磷菌的GFP 標記及其在復墾土壤中的定殖

王向英 ，高建華 ，孟會生 ，張 杰 ，武 欣 ，洪堅平

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西農業大學資源環境學院，山西太谷030801）

山西是煤炭大省，煤炭開采和復墾過程中的工程措施都會對土壤造成擾動，導致重構（復墾）土壤生產力低下，養分極度缺乏[1]。復墾土壤常因缺磷使固氮效率很低，磷素已成為限制礦區復墾土壤養分提升的主要因子[2-3]，施用的磷肥也常因土壤的固定作用而效果不佳[4]。解磷微生物可將土壤中的難溶磷（有機磷或無機磷）轉化為植物可利用的有效磷[5-6]。一些解磷菌還可以固氮，產生吲哚乙酸（IAA）、鐵載體來促進植物生長[7-9]。因此，施用解磷微生物對復墾土壤中磷素活化以及促進植物對氮、磷的吸收具有積極作用。CHEN 等[10]從山西復墾土壤中篩選得到解磷菌S32，該菌株對難溶磷有較高的溶解能力，可明顯提高復墾土壤中有效磷含量，顯著提高水稻的株高、生物量、根系生長和磷的吸收。栗麗等[11]研究發現，與未接種解磷菌的處理相比，解磷菌能夠促進磷礦粉和磷酸鈣在復墾土壤中磷的生物有效性，提高盆栽油菜對磷的吸收。喬志偉等[12]研究表明，復墾土壤中施用解磷菌，可以改善土壤磷素的解吸特征，有利于土壤快速培肥，增加作物產量。孟會生等[13]研究表明，解磷菌肥與有機無機肥配施能夠提高復墾土壤有效磷含量及堿性磷酸酶活性，促進土壤微生物群落多樣性恢復，進而改善復墾土壤結構和肥力。

為準確回收投放到環境中的功能微生物，檢測微生物在植物根際和土壤中的定殖情況，首先要對微生物進行標記。在諸多標記法中，綠色熒光蛋白（GFP）標記因具有基因小、靈敏度高、穩定性好、可以實時原位監測等優點，在研究微生物與環境、宿主相互作用，基因表達調控等方面得到廣泛的應用[14-15]，是目前理想的報告基因。但在實踐中常出現解磷微生物田間作用效果不穩定的現象，制約了解磷菌肥的推廣使用[5]。施用到土壤中的解磷微生物首先能夠在土壤或植物根際有效定殖，才能發揮其解磷功能[16]。因此，研究解磷微生物在土壤及植物根際的定殖能力，對闡明其在土壤中的實際解磷效果具有重要意義。

本研究將含有GFP 的質粒轉入前期分離的解磷菌w134 和w137 中，通過測定標記前后菌體的生長曲線和解磷能力變化來評估GFP 標記對菌株的影響，并初步研究其在復墾土壤中的定殖能力，為后期研究其在復墾土壤中的實際應用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

解磷菌w134 和w137 分離自山西襄垣的礦區土壤，經鑒定2 株菌均為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescence）。質粒 pRTGFP 為組成型 GFP基因（1.4 kb）克隆到廣宿主載體pTR102 上，具有氨芐青霉素（Amp）和四環素（Tet）抗性，保存在大腸桿菌DH5α 中，由南京農業大學鐘增濤教授惠贈。試驗所用抗生素購自北京索萊寶科技有限公司。內切酶KpnⅠ和BglⅡ購自紐英倫生物技術（北京）有限公司（NewEngland Biolabs）。

含GFP 質粒的大腸桿菌DH5α 與解磷菌w134和 w137 均采用 LB 培養基，分別在 37、30 ℃條件下培養。測定w134 和w137 解磷能力時采用NBRIP培養基，配方為：葡萄糖10 g、Ca（3PO4）25 g、MgCl·22H2O 5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、KCl 0.2 g、（NH4）2SO40.1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值為 7.0。

定殖試驗的土壤取自山西襄垣采煤塌陷區生土，土壤類型為石灰性褐土，取回的土壤風干后過2 mm 篩，備用。有機肥為腐熟雞糞，購自太谷鴻昊養殖場。

1.2 方法

1.2.1 GFP 標記菌株構建 將含GFP 質粒的大腸桿菌DH5α 活化，挑取單菌落于3 mL 含有Amp 50 μg/mL 和 Tet 50 μg/mL 的 LB 培養液中，37 ℃，180 r/min 過夜培養。按照質粒提取說明書（TIANGEN）步驟提取質粒，1%的瓊脂糖凝膠電泳，Nanodrop 2000 測定質粒濃度，-20 ℃保存備用。

w134 和w137 的感受態制備和高壓電擊轉化按照李曉婷[16]的方法進行；電擊后迅速加入800 μL的 LB 培養液，30 ℃、100 r/min 培養 2 h；隨后取100 μL 培養液涂布到含有 Amp 50 μg/mL 和 Tet 50 μg/mL 的 LB 平板上，30 ℃培養，觀察是否有轉化子長出；從有轉化子長出的平板上隨機挑取單菌落，接入含有相應抗生素濃度的LB 液體中，30 ℃、180 r/min 培養過夜；在熒光顯微鏡（OLYMPUS）下觀察菌株是否有綠色熒光，并提取質粒。配置30 μL的酶切體系：10×Buffer 3 μL、酶BglⅡ0.5 μL、酶KpnⅠ0.5 μL、質粒 DNA 26.0 μL，置于 37 ℃，水浴30 min，后用1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2 標記菌株的穩定性檢測 在非選擇壓力下檢測標記菌的穩定性[17]。用不含抗生素的LB 液體培養基進行培養，對GFP 標記菌株在指數期以1%的接種量連續轉接15 代，相當于連續平板傳代培養100 代[18]；后蘸取第15 代培養的菌液在含有抗生素的LB 平板上劃線，挑取單菌落，小搖，提質粒。并且在熒光顯微鏡下觀察菌株是否還有綠色熒光。

1.2.3 標記前后菌株生長曲線比較 分別挑取野生菌和GFP 標記菌的單菌落于3 mL LB 中培養，當OD600值約0.5 時，按1%接種量接入含100 mL LB的三角瓶中，3 次重復，30 ℃、180 r/min 連續培養，每1 h 取樣一次，于600 nm 下測定其OD 值。

1.2.4 標記前后菌株解磷能力比較 平板測定：將野生菌和GFP 標記菌分別點種在NBRIP 固體平板上，30 ℃培養7 d，測定菌落直徑和透明圈直徑，計算透明圈與菌落直徑比。

液體培養測定：按1%的接種量接入NBRIP 液體培養基中，設 3 個重復，30 ℃、180 r/min 培養 7 d；每天取樣5 mL，于10 000 r/min 離心 10 min，用鉬藍比色法測定上清液中有效磷含量。

1.2.5 標記菌株在復墾土壤中的定殖 將標記菌w134GFP、w137GFP 分別接入復墾土壤中，試驗設未滅菌土壤（N）、未滅菌土壤+有機肥（NM）、滅菌土壤（S）、滅菌土壤＋有機肥（SM）共 4 個處理，觀察菌株在90 d 內的定殖動態以及土壤滅菌和施加肥料對定殖的影響（表1）。每盆裝650 g 土，按照5%（V/m）的接種量接入標記菌的菌懸液（1.0×109cfu/mL），土壤中菌體的初始含量為5.0×107cfu/g，每處理3 個重復。前42 d 每7 d 進行一次涂板計數，之后每10 d 進行一次涂板計數，期間保持土壤含水量在12%左右。

表1 標記菌在復墾土壤中定殖試驗設計

每次涂板計數之前將盆中的土混合均勻，每盆取10 g 土，按照平板稀釋涂布法，涂布于含Amp 50 mg/L 和 Tet 50 mg/L 的 LB 平板上，30 ℃培養36～48 h，觀察計數。

1.3 數據處理

采用Excel 進行數據和圖表處理；方差分析利用SPSS 21.0 軟件進行。

2 結果與分析

2.1 GFP 標記菌株的構建與檢測鑒定

野生菌w134 和w137 均不能在Amp 50 mg/L和Tet 50 mg/L 的雙抗平板上生長，而GFP 質粒具有Amp 和Tet 抗性，電擊轉化后能在LB 雙抗平板上生長的菌落即為轉化子，記為w134GFP 和w137GFP。熒光顯微鏡中可以觀察到轉化子都帶有強烈的綠色熒光（圖1-A），說明質粒pTRGFP 已分別轉入w134 和w137 中且GFP 基因成功表達。提質粒酶切后的條帶如圖1-B 所示，與大腸桿菌DH5α的GFP 質粒酶切后的條帶相同，且都有一個大約1.4 kb 的條帶，與組成型的GFP 大小一致，再次證明GFP 質粒已成功轉入w134 和w137 中。

2.2 標記菌的穩定性試驗

在不加抗生素的條件下，將連續傳代培養15 代后的w134GFP 和w137GFP 進行熒光檢測和質粒提取，仍可以看見強烈的綠色熒光，并提取出相應的質粒。說明GFP 質粒在w134GFP 和w137GFP 傳代過程中可穩定表達，可進行后續的定殖試驗。

2.3 GFP 標記前后菌株生長情況比較

由圖 2 可知，2 株解磷菌 w134 和 w137 在 GFP標記前后的生長曲線基本一致，0～2 h 為延遲期，2～8 h 是對數生長期，8 h 后進入穩定期。值得注意的是，w134GFP 的 OD 值在前 8 h 內略低于 w134，w137GFP 的OD 值在前7 h 內略低于w137。可見，GFP 標記對解磷菌的生長速度略有影響，但均未影響2 個菌株最終的生長量。

2.4 GFP 標記前后菌株的解磷能力比較

溶磷圈可以展現解磷菌解磷能力的大小，溶磷圈直徑與菌落直徑比值越大，說明解磷能力越強[19]。

由表 2 可知，w134 的 D/d 高于 w134GFP，分別為 1.37 和 1.29；w137 的 D/d 高于 w137GFP，分別為1.66 和1.57，且標記前后的D/d 無顯著差異（P＞0.05）。說明GFP 標記后均在磷酸三鈣平板上的解磷能力略有下降，但差異不顯著（P＜0.05）。

表2 GFP 標記前后菌株在NBRIP 平板上的溶磷圈

菌株的解磷能力一般以NBRIP 培養液中有效磷的多少來衡量[19]。由圖3 可知，標記菌在NBRIP培養液中有效磷含量的變化曲線和對應的野生菌基本一致；w134 和w134GFP 在NBRIP 培養液中最大有效磷含量分別為 562.07、529.68 mg/L（圖3-A），w137 和 w137GFP 在 NBRIP 培養液中最大有效磷含量分別為624.35、596.32 mg/L（圖3-B）。可見，GFP 標記后w134 和w137 的解磷能力均有所降低，但是沒有造成菌株解磷能力的顯著降低或者喪失。

2.5 標記菌在復墾土壤中的定殖動態

不同處理條件下標記菌在復墾土壤中90 d 定殖動態變化如圖4 所示，從總體上看，不論土壤是否滅菌、是否添加有機肥，w134GFP 和w137GFP 的定殖數量都是隨時間的延長逐漸降低。2 株菌在接種7 d 達到定殖數量的最高值，w134GFP 的數量在7.6×108cfu/g，w137GFP 的數量在 9.8×109cfu/g；接種 35 d 時，2 株菌數量分別降到 4.6×104、4.5×104cfu/g；接種 93 d，2 株菌數量已降至 10～20 cfu/g，達到檢測的下限。

進一步分析發現，未滅菌土壤＋有機肥（NM）處理下的菌體數量在28～58 d 時高于未滅菌土壤不施肥（N）處理，即NM＋w134GFP＞N＋w134GFP，NM＋w137GFP＞N＋w137GFP；而滅菌土壤＋有機肥（SM）處理下的菌體定殖數量在0～28 d 高于滅菌土壤不施肥（S）處理，即SM＋w134GFP＞S＋w134GFP，SM＋w137GFP＞S＋w137GFP。可見，添加有機肥可以促進w134GFP 和w137GFP 在復墾土壤中的定殖。

不施有機肥時，在0～21 d，滅菌土壤（S）中的標記菌數量高于未滅菌土壤（N），即S＋w134GFP＞N＋w134GFP，S＋w137GFP＞N＋w137GFP；到 28 d 時滅菌土壤（S）處理均低于不滅菌土壤（N）處理；28 d后土壤滅菌和不滅菌處理間的菌體數量基本持平。添加有機肥（M）時，在0～28 d 滅菌土壤＋有機肥（SM）處理中標記菌數量高于不滅菌土壤＋有機肥（NM）處理的，即 SM＋w134GFP＞NM＋w134GFP，SM＋w137GFP＞NM＋w137GFP；在 28～58 d 時生長發生逆轉，不滅菌土壤+有機肥（NM）處理中的標記菌數量高于滅菌土壤＋有機肥（SM）處理，58 d之后二者菌體數量持平。

從2 株標記菌的整個定殖過程來看，4 個處理的定殖效果也不盡相同，0～28 d，滅菌土壤+有機肥（SM）處理的菌體數量高于其他3 個處理；28～58 d，不滅菌土壤＋有機肥（NM）的菌體數量高于其他3 個處理；58 d 之后4 個處理之間菌體數量差異不大。

3 討論

3.1 GFP 標記對菌體生長和解磷能力的影響

綠色熒光蛋白（GFP）以標記基因小、基因表達產物對細胞沒有毒害的作用、安全穩定、熒光標記檢測方便等優點[14]，成為研究功能微生物在自然環境中存活與定殖狀況的有效手段。許多研究證實[15-17，20]，GFP 可對不同物種進行標記，而且標記菌株與出發菌株的生長速率無明顯差別，功能活性相當，連續培養條件下標記菌株的GFP 可穩定遺傳。本試驗也采用了GFP 標記，而且經過連續15 代的無選擇壓力的傳代培養，熒光顯微鏡下仍能看見強烈的綠色熒光，并能提取出相應的質粒。說明GFP質粒表達穩定，解磷菌w134 和w137 的GFP 標記菌株構建成功。

從生長曲線來看，標記菌的生長曲線與野生菌的基本一致，只是標記菌在前7～8 h 的OD 值略低于野生菌。可見，引入的GFP 質粒還是稍微增加了細胞的代謝負荷，削弱了菌株的適應性。這與李曉婷[16]的研究結果一致。

雖然有研究認為，解磷圈的大小不能準確反映解磷能力的強弱[19]，但對于同一菌株來說，溶磷圈仍舊可以粗略地展現GFP 標記前后解磷能力的變化。本研究中，標記菌的D/d 值略小于野生菌，應該是受導入質粒的影響。通常，研究解磷能力還是以NBRIP 培養液中有效磷的多少來衡量。本研究結果表明，標記菌和野生菌在NBRIP 培養液中解磷能力沒有顯著差別，說明GFP 質粒轉入對w134 和w137的解磷能力影響不大。張磊等[20]和張霞等[21]的研究也發現，GFP 基因的導入基本不影響解磷菌的解磷能力。總之，GFP 標記對w134 和w137 的生長和解磷能力沒有顯著影響，而且GFP 質粒遺傳穩定，可以用于后續的定殖試驗。

3.2 解磷菌在復墾土壤中的定殖

外來功能菌在自然土壤中定殖的典型特征是：在接種后最初幾天細菌群體的生長呈增加趨勢，然后開始持續下降直至檢測下限（約50 cfu/g）。本研究結果表明，w134GFP 和w137GFP 在復墾土壤中的定殖數量在接種7 d 時達最大值分別為7.6×108、9.8×109cfu/g；之后逐漸降低，35 d 降到 4.5×104cfu/g；93 d 降到 10～20 cfu/g。喬志偉[19]研究發現，在磷細菌＋葡萄糖＋尿素＋基質處理的土壤中，磷細菌數量在接種7 d 達到最大值1.0×108cfu/g，隨后逐漸降低，60 d 降到約3.3×104cfu/g，與本研究定殖規律類似。但也有研究發現，解磷菌在土壤中的定殖數量一直呈下降趨勢，沒有增加現象。李曉婷等[16]研究發現，解磷菌K3 在土壤中數量在35 d內從 1.0×109cfu/g 降低到 1.0×103cfu/g 左右；張霞等[21]研究發現，GFP 標記菌與出發菌株在土壤中的消長動態相似，隨時間延長定殖數量下降，接種60 d 的數量分別為 1.63×104、3.30×102cfu/g，100 d檢測不到。王珍等[22]研究也發現，解磷菌WY4-GFP在小白菜根際及土壤中的定殖規律是隨時間的增加定殖數量逐漸減少。外來微生物定殖數量緩慢下降是一個共性的現象，但不同菌株在土壤中定殖的數量和時間，以及會不會在接種的最初幾天里數量增加，都不盡相同。這可能是由于植物根系與微生物[23]、微生物之間相互作用的復雜性，以及土壤質地、水分特征等理化性質的影響[24]，因此，很難對所觀察到這一現象進行理論上的分析，要揭示環境因子對菌株定殖的影響，還有待今后深入研究。

在土壤是否滅菌上，韋兵等[25]研究發現，滅菌土壤中JK45-L 菌的數量下降的速度明顯比不滅菌土壤中慢；王平等[24]也研究發現，熒光假單胞菌X16L2 在滅菌土壤中的存活量要顯著高于不滅菌土壤。本試驗研究也發現，在接菌的前28 d內，滅菌土壤組中w134GFP 和w137GFP 的定殖數量高于對應的未滅菌土壤中的定殖數量。可見，與自然土壤相比，滅菌土壤中因沒有土著微生物的拮抗作用和競爭作用，也沒有原生動物的捕食作用以及噬菌體引起的細胞潰溶，外來微生物更容易定殖。但隨著時間延長，土壤滅菌和不滅菌對定殖的影響逐漸減小。58 d 時，土壤滅菌組的標記菌數量在（2.3～3.1）×103cfu/g，未滅菌土壤組的標記菌數量在（2.6～4.5）×103cfu/g，差別不大。余旋[26]研究也有類似的發現，滅菌土和未滅菌土中接種的磷細菌數量在60 d 后分別為 3.38×103、3.40×103cfu/g，滅菌土和未滅菌土中接種的磷細菌數量相當。

外來微生物施入土壤發揮作用的一個前提條件就是要能夠進行有效定殖，在諸多影響外來菌株根際定殖的因素中，首先是土壤或根系分泌的營養物質對外來微生物的影響。NINWE 等[27]將GFP 標記的熒光假單胞菌SBW25 施入土壤中，結果發現，SBW25 的很大一部分變得不活躍或者死亡，這可能表明細胞在土壤中進入休眠狀態，類似于在純培養的饑餓條件下觀察到的。NORMANDE 等[28]也研究發現，將熒光假單胞菌DR54-BN14 接種到土壤中21～28 d 后，DR54-BN14 細胞大部分處于饑餓狀態。而虞偉斌[29]則研究發現，添加有機肥能促進解磷菌GFPK3 在土壤中的定殖。本研究也發現，在配施有機肥的處理中，滅菌土壤中標記菌的數量在21～35 d 高于不施肥處理，類似地自然土壤中標記菌數量在28～42 d 高于對應的不施肥處理，這可能是由于配施有機肥的作用。復墾土壤養分貧瘠，可供微生物生長的能源物質較少，解磷菌從室內分離培養到釋放復墾土壤中，營養條件發生巨大的反差，容易造成菌體死亡或休眠，而有機肥可以給菌株提供合適的碳氮源以及生存空間，增強其在復墾土壤中的定殖能力。

本試驗利用電擊轉化法獲得了遺傳穩定的GFP 標記菌株w134GFP 和w137GFP，并且標記菌和野生菌在生長曲線和解磷能力上無顯著差異。對標記菌在復墾土壤中的定殖能力進行研究，結果發現，w134GFP 和 w137GFP 均在接種 7 d 達到定殖數量的最高值，分別為 7.6×108、9.8×109cfu/g，之后標記菌數量逐漸下降，可在復墾土壤中定殖93 d左右。說明w134GFP 和w137GFP 可以作為研究解磷菌在復墾土壤中定殖能力的特征材料，對進一步揭示解磷菌在復墾土壤中的生態功能奠定基礎。