深海熱液區(qū)超嗜熱古菌太平洋古球菌Palaecoccus pacificus DY20341T高溫淀粉酶系分析

胡俊西，張 靜，曾 湘*

(1.閩南師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363099; 2.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門(mén) 361005)

淀粉酶(Amylase)是一類(lèi)降解淀粉和糖原的酶類(lèi)總稱(chēng)，僅水解淀粉分子鏈中的α-1,4-葡萄糖苷鍵，將淀粉鏈切斷成為短鏈糊精、寡糖和少量麥芽糖及葡萄糖；普遍地存在于植物、動(dòng)物和微生物中，并具有廣泛的工業(yè)用途。環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Cyclodextrin Glucanotransferase, CGTase，EC 2. 4. 1. 19)是α-淀粉酶家族的重要成員，能將淀粉通過(guò)環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精。葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(α-glucanotransferase)能切斷糖苷鍵，并轉(zhuǎn)移葡聚糖(1, 4-alpha-D-glucan)至新的碳水化合物上，如葡萄糖或葡聚糖[1-2]。高溫淀粉酶通常是指酶活性最適溫度在60 ℃以上的淀粉酶，高溫淀粉酶具有高溫條件下熱穩(wěn)定性強(qiáng)、保存條件廣、節(jié)約能源、成本低、易于保存和運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于釀酒、制糖、去污、紡織等行業(yè)[3]。

熱球菌目是深海熱液區(qū)一類(lèi)常見(jiàn)的超嗜熱古菌，其可以利用蛋白質(zhì)、多糖類(lèi)進(jìn)行異養(yǎng)代謝，具有豐富的碳水化合物降解系統(tǒng)，包括對(duì)淀粉、糖原、多糖的降解。已報(bào)道的來(lái)源于熱球菌目的高溫淀粉酶都具有嗜熱、耐酸的特性，如Pyrococcusfurious[4]、Pyrococcuswoesei[5]、ThermococcusonnurineusNA1[6]、Thermococcussp. HJ21[7]。但前期研究通常局限于單一淀粉酶的性質(zhì)研究，而未對(duì)菌株淀粉酶系進(jìn)行酶學(xué)和系統(tǒng)分析。

超嗜熱古菌太平洋古球菌PalaecoccuspacificusDY20341T屬于熱球菌目，分離自東太平洋鳥(niǎo)巢海底丘熱液沉積物[8]，其高溫淀粉酶系是適應(yīng)熱液環(huán)境的特殊機(jī)制之一。本研究對(duì)PalaecoccuspacificusDY20341T高溫淀粉酶系的序列及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，可為淀粉酶發(fā)酵工業(yè)高產(chǎn)菌株資源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和基因組序列

太平洋古球菌PalaecoccuspacificusDY20341T(=JCM 17873T= DSM 24777T=MCCC 4A00001T)的基因組序列信息已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào)為CP006019)。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

TRM培養(yǎng)基(1 L)：酵母膏1 g，蛋白胨4 g，氯化鈉23 g，六水合氯化鎂5 g，氯化鈣0.15 g，氯化鉀0.7 g，硫酸銨0.5 g，溴化鈉0.05 g，氯化鍶0.01 g，PIPES 3.3 g，0.5 mol/L氯化鐵50 μL，1 g/L刃天青800 μL，用氫氧化鈉將pH調(diào)至7.0。121 ℃，20 min滅菌后，加入單獨(dú)滅菌的6%磷酸氫二鉀1 mL，6%硫酸二氫鉀1 mL，硫粉10 g。充入氮?dú)馊コ鯕猓尤虢K濃度為0.025%的硫化鈉至培養(yǎng)基無(wú)色。

將菌株DY20341T種子液按1∶50接種到含TRM培養(yǎng)基的厭氧瓶中。80 ℃條件下恒溫培養(yǎng)15 h，到達(dá)其生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

1.3 粗酶液制備方法

將培養(yǎng)液于3 000 r/min離心5 min，去除單質(zhì)硫；上清于10 000 r/min離心20 min后所得菌體用裂解緩沖液重懸，超聲波低溫破碎2.5 min；溶液于13 000 r/mm離心30 min，所得上清即為粗酶液。

1.4 淀粉酶粗酶液酶活性測(cè)定

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1 g，溶解稀釋后定容于100 mL容量瓶中，配成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，精密吸取貯備液1 mL定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μL于25 mL具塞刻度試管中，加蒸餾水至2.0 mL，再各加6%苯酚溶液1.5 mL搖勻，迅速加入濃硫酸溶液5 mL，振搖，放置10 min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，以空白為參比測(cè)定OD540，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線中葡萄糖各濃度梯度的點(diǎn)能形成良好線性關(guān)系，且R2>0.99。

1.4.2 酶活性測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸比色法(DNS)測(cè)量還原糖的含量，表示酶活性[9]。

實(shí)驗(yàn)組體系為：1 mL 1%(W/V，下同)淀粉緩沖液+1 mL無(wú)菌去離子水+100 μL粗酶液；對(duì)照組體系為：1 mL 1%淀粉緩沖液+1 mL 2 mol/L氫氧化鈉+100 μL粗酶液。反應(yīng)30 min后立即取出，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)加入1.5 mL DNS，并且實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)加1 mL 2 mol/L氫氧化鈉，每管都沸水浴10 min。各組冷卻后加水補(bǔ)齊到15 mL，取200 μL測(cè)定OD540。

本研究中酶活性單位定義為在上述一定條件下，每分鐘從1%可溶性淀粉溶液中釋放出1 mmol葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.5.1 淀粉酶蛋白的SDS-PAGE復(fù)性膠檢測(cè) 用含有0.3%的可溶性淀粉的12% PAGE進(jìn)行蛋白分子量和淀粉酶活性的檢測(cè)。一側(cè)電泳膠用考馬斯亮藍(lán)染色確定分子量；另一側(cè)在含2.5% Triton X-100的50 mmol/L磷酸氫二鈉(pH 7.0)溶液中室溫下復(fù)性1 h，再放入乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)中，95 ℃反應(yīng)1 h。用含0.15%碘液和1.5%碘化鉀的溶液染色2 min，形成的透明條帶即為淀粉酶活性條帶。

1.5.2 酶的反應(yīng)溫度 將粗酶液分別置于50、60、70、80、90、100 ℃(水浴)和110 ℃(高壓滅菌鍋)溫度下，測(cè)定淀粉酶活性。

1.6 淀粉酶序列信息分析

利用SignalP 4.1在線分析蛋白的信號(hào)肽序列[10]；利用SMART數(shù)據(jù)庫(kù)和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)分析其所屬家族和保守區(qū)域；利用Swiss-PdbViewer 4.0.4預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域；利用BLAST在線軟件和DNAMAN軟件進(jìn)行相似性、保守結(jié)構(gòu)域分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.1.1 酶的反應(yīng)溫度 菌株DY20341T的粗酶液在60～110 ℃范圍內(nèi)均具有淀粉酶活性，在100 ℃時(shí)酶活性最高(圖1)。

圖1 溫度對(duì)菌株DY20341T培養(yǎng)液上清中淀粉酶粗酶活性的影響

2.1.2 淀粉酶蛋白分子量的檢測(cè) 由SDS-PAGE復(fù)性膠染色的結(jié)果(圖2)可以看出4個(gè)淀粉酶在pH 5.0、95 ℃的條件下均有活性。條帶1、2、3、4分別對(duì)應(yīng)淀粉酶1(PAP09225，約77 kDa)形成的二聚體、淀粉酶2(PAP01075，約82 kDa)、淀粉酶3(PAP09095，約61 kDa)、淀粉酶4(PAP00275，約53 kDa)。推測(cè)PAP09225形成的二聚體在SDS-PAGE上的分子量約為150 kDa左右。

圖2 菌株 DY20341T總蛋白聚丙烯酰胺凝膠(a)及淀粉酶復(fù)性膠(b)

2.2 淀粉酶序列分析

2.2.1 同源蛋白序列比對(duì) 根據(jù)氨基酸序列Blastp在線比對(duì)結(jié)果，PAP09225與Archaeoglobusfulgidus的環(huán)糊精糖苷轉(zhuǎn)移酶(YP_002993870.1)序列相似度最高，為85.41%, 與來(lái)源于Pyrococcusfurious的PF0272(NP_578001.1)序列相似度為65%[4]；PAP01075與ThermococcusbarophilusMP的環(huán)糊精糖苷轉(zhuǎn)移酶(YP_004071653.1)序列相似度最高(69.46%)；PAP09095與ThermococcuslitoralisDSM 5473的α-淀粉酶(ZP_09729791.1)序列相似度最高(60.84%)；PAP00275與Thermococcuscleftensis的α-淀粉酶(WP_014788878.1)序列相似度最高，為82.00%。將后兩者與已知α-淀粉酶進(jìn)行了同源比對(duì)，可見(jiàn)4個(gè)典型的α-淀粉酶活性位點(diǎn)(圖3)。

圖3 來(lái)源于菌株DY20341T的α-淀粉酶(PAP00275和PAP09095)與其他淀粉酶序列的比對(duì)結(jié)果

另外，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析了已知的20株嗜熱古菌基因組序列(其中熱球菌目菌株17株)，發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶在超嗜熱古菌中的數(shù)目有較大差異(表1)。在熱球菌目中，Thermococcusbarophilus、Thermococcussibiricus、Pyrococcussp. ST04、Pyrococcussp. NA2中沒(méi)有α-淀粉酶，而Thermococcuskodakaraensis、PyrococcusfuriosusDSM 3638和PalaeococcuspacificusDY20341T則含有兩個(gè)α-淀粉酶?？梢?jiàn)，熱球菌目菌株淀粉及糖原代謝具有多樣性，是其個(gè)體選擇適應(yīng)環(huán)境的一種方式。

表1 利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到的已知嗜熱古菌α-淀粉酶數(shù)目

續(xù)表1

2.2.2 信號(hào)肽、活性位點(diǎn)、保守區(qū)域分析 利用SignalP-4.1在線預(yù)測(cè)4個(gè)淀粉酶信號(hào)肽：PAP00275的1～28位的氨基酸是信號(hào)肽，29～30位預(yù)計(jì)為切割位點(diǎn)，為胞外酶；PAP01075的1～19位的氨基酸是信號(hào)肽，預(yù)測(cè)其為胞外酶；PAP09095和PAP09225中沒(méi)有信號(hào)肽，為胞內(nèi)酶。

將4個(gè)蛋白的氨基酸序列提交到Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析(表2)。PAP01075、PAP09095、PAP00275屬于α-淀粉酶家族的成員，且都只有在α-淀粉酶的催化區(qū)域有預(yù)測(cè)的活性位點(diǎn)。PAP09225和PAP00275序列中還包含有DUF結(jié)構(gòu)域的序列。DUF結(jié)構(gòu)域最早是在原核生物的轉(zhuǎn)移酶中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域，功能未知。Imamura等(2003)推測(cè)他們與轉(zhuǎn)糖基的作用有關(guān)[11]。

表2 利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)4個(gè)淀粉酶的所屬家族和活性位點(diǎn)

PAP09225屬于糖苷水解酶GH-57家族(Glycosyl Hydrolase Family 57)，GH-57家族是一個(gè)糖苷水解酶家族，除了能夠水解二糖和多糖的糖苷鍵，還能水解糖和非糖物質(zhì)之間的糖苷鍵，具有淀粉酶催化活性。該家族成員大多來(lái)自極端微生物，包括α-淀粉酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、普魯蘭酶等[12]。根據(jù)保守序列比對(duì)和進(jìn)化分析推測(cè)PAP09225是一個(gè)胞內(nèi)4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.25)。其空間結(jié)構(gòu)與Thermococcuslitoralis1K1X類(lèi)似，N-端的結(jié)構(gòu)域A中的pseudo-TIM桶狀折疊，是催化殘基所在的保守區(qū)域。SDS-PAGE結(jié)果顯示PAP09225是一個(gè)二聚體，這與1K1X晶體結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果[11]一致。

PAP01075是胞外環(huán)糊精葡糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.19)，含有環(huán)糊精糖苷轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列所共有的4個(gè)保守區(qū)域。與其序列最相似和進(jìn)化關(guān)系最近的是ThermococcusbarophilusMP的環(huán)糊精葡糖轉(zhuǎn)移酶(YP_004071653.1)。

PAP09095與PAP00275均屬于α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)的GH-13家族。PAP09095是胞內(nèi)α-淀粉酶，含有α-淀粉酶4個(gè)保守區(qū)域。與最近的同源蛋白氨基酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，在N端多出的100個(gè)氨基酸是鋅指SWIM區(qū)域蛋白，但功能未知。PAP00275是胞外淀粉酶，具有α-淀粉酶保守的(β/α)8TIM桶狀結(jié)構(gòu)，含有α-淀粉酶全部4個(gè)保守區(qū)域，與Pyrococcuswoesei耐熱α-淀粉酶(3QGV)的序列和空間結(jié)構(gòu)相似度極高(圖4)。

圖4 耐熱α-淀粉酶的三維結(jié)構(gòu)模型

2.3 其他淀粉/糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

在菌株DY20341T基因組中共發(fā)現(xiàn)5個(gè)與糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。Mal-I和 Mal-IV, 包括 malEFGK，可轉(zhuǎn)運(yùn)三糖和更長(zhǎng)鏈的多糖，包括淀粉；Mal-II與Thermococcussibiricus的最相近，特異轉(zhuǎn)運(yùn)麥芽低聚糖；Mal-III轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)麥芽糖和海藻糖; 另一個(gè)糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Mal-V可轉(zhuǎn)運(yùn)糖類(lèi)，包括乙酰葡萄糖胺。

3 結(jié)論

生理分析結(jié)果表明菌株DY20341T可以降解淀粉作為碳源[8]，存在完整的胞外降解、轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解途徑[12]。其分泌胞外淀粉酶(PAP00275)和胞外環(huán)糊精葡糖轉(zhuǎn)移酶(PAP01075)，將淀粉等長(zhǎng)鏈糖原降解生成麥芽糖和葡萄糖。由Native-PAGE可以看出，胞外淀粉酶PAP00275具有相對(duì)較高的酶活。部分淀粉和糖原可直接轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，由胞內(nèi)淀粉酶(PAP09095)和胞內(nèi)4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(PAP09225)進(jìn)一步降解糖原和多糖為單糖。在菌株DY20341T胞內(nèi)，被降解后的單糖作為能源可進(jìn)入糖酵解途徑(Embden-Meyerhof pathway)和不完整的三羧酸循環(huán)[13]。本研究結(jié)果證實(shí)，與其他熱球菌目菌株相比，太平洋古球菌PalaeococcuspacificusDY20341T具有更豐富的淀粉降解體系，且其產(chǎn)生的淀粉酶均在高溫下具有較好的活性，是該菌株適應(yīng)熱液區(qū)原位高溫環(huán)境的一種適應(yīng)機(jī)制。