ARTP誘變法分析深海沉積微桿菌Microbacterium sediminis YLB-01的耐壓耐冷機理

邱 旭, 許薷方, 魏士平, 湯熙翔*

(1. 中國地質大學(北京)海洋學院, 北京 100083; 2. 自然資源部第三海洋研究所, 福建 廈門 361005)

深海是全球最大的獨立生態系統, 是指水深超過1 000 m的區域, 包括深層海水、表層沉積物、冷泉、熱液以及多金屬結核區等特殊生境[1-2]。相對于陸地微生物, 深海及深海沉積物中的微生物面臨高壓、低溫、黑暗及低營養水平等多種極端環境[3]。在這些環境中生存著的微生物由于長期適應極端條件而進化成為相應的極端微生物[4-5]。

在深海中, 最典型的環境因素為低溫(2～4 ℃)、高壓(平均38.5 MPa)以及熱液區和硫化物區的極端氧化還原梯度環境。極端微生物研究有著較為廣闊的前景。極端微生物本身蘊藏的獨特基因是極其寶貴的資源；極端環境適應性蛋白和極端酶的應用價值巨大；極端環境微生物在環境修復、資源利用、生物煉制和生物冶金等領域的應用前景廣闊；極端環境微生物研究也是生物圈與地圈協同演化、生命與環境相互作用等重大科學問題的基礎[6]。

深海沉積微桿菌MicrobacteriumsediminisYLB-01是分離自西南印度洋沉積物中的一株革蘭氏陽性放線菌。菌落呈白色、邊緣光滑的球狀。菌株有一定的低溫、高壓耐受性，溫度生長范圍為4～50 ℃ (最適28 ℃), 壓力生長范圍為0.1～80.0 MPa (最適0.1 MPa), NaCl耐受范圍為0%～8% (質量分數，最適5%), pH生長范圍為5.0～10.0 (最適pH 7.0)[7]。

已有轉錄組和代謝組的研究表明,M.sediminisYLB-01的冷適應與氨基酸和碳水化合物代謝密切相關。在低溫環境下YLB-01會表現出冷應激, 且碳水化合物代謝明顯紊亂。同時, 其對數生長期的三羧酸循環受到抑制, 而平臺期細胞表現為丙酮酸減少和乳酸增加[8]。

本研究旨在通過對M.sediminisYLB-01進行常壓室溫等離子體誘變(Atmospheric and Room Temperature Plasma, ARTP), 篩選出突變后對低溫和高壓敏感的突變子并進行重測序, 分析其突變位點和突變類型等信息, 為研究M.sediminisYLB-01的低溫、高壓環境適應性機制提供幾種研究方向與思路, 為進一步闡明其低溫高壓適應性機理提供佐證, 為深部生物圈生物的環境適應性機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究采用的菌株M.sediminisYLB-01為課題組保種。

1.2 試劑

實驗所用培養基為胰蛋白胨大豆肉湯(TSA)：胰蛋白胨大豆肉湯粉30 g, 溶于超純水, 定容至1 L(固體培養時再加入15 g的瓊脂), 121 ℃高壓滅菌20 min。試劑包括體積分數為50%的甘油(無菌)和過濾除菌的氟化液(比利時Fluorinert, FC-40)。

1.3 實驗儀器

實驗儀器包括常壓室溫等離子體人工誘變儀(無錫源清天木, ARTP-M)、高壓微生物培養釜加壓裝(南通飛宇)、酶標儀(美國伯樂, Model 680)、超凈工作臺(蘇凈安泰, VT-840-V)、滅菌鍋(日本Hirayama, HVE-50)、恒溫培養箱(上海一恒, LRH-150)、搖床(上海旻泉, MQT-60R)。

1.4 實驗方法

1.4.1 ARTP誘變 取50 μL培養至對數期(OD600=0.6)的菌液滴加在無菌的不銹鋼板上, 并在無菌空氣中干燥幾分鐘。調節設備輸入氦氣流速為15 L/min, 功率為100 W, 菌液在此條件下分別處理20、40、60、80、100、120 s, 每種條件做3個重復。將處理過后的菌體用2 mL的無菌生理鹽水洗脫, 重懸后取200 μL涂布于固體平板上, 28 ℃, 0.1 MPa培養至長出單菌落[9-11]。

1.4.2 初篩 挑取固體平板上長出的單克隆, 分別接種于裝有無菌TSA培養基的96深孔板中, 28 ℃, 0.1 MPa, 180 r/min培養至對數期。向對數期的單克隆菌液中加入等量無菌的50%甘油進行保種。

低溫敏感突變子篩選：分別取保種的菌液以1∶10進行復蘇, 培養至對數期后再次以1∶10接種于1.5 mL培養基中, 4 ℃, 0.1 MPa, 180 r/min培養15 d。15 d后分別取200 μL菌液測定OD600, 每個菌液3個重復。

高壓敏感突變子篩選：分別取保種的菌液以1∶10進行復蘇, 培養至對數期后再次以1∶10接種于1.5 mL培養基中。對充氧2 h的氟化液進行過濾除菌, 并與菌液以2∶1的比例混合, 取無菌的巴斯德管分別吸入菌液, 排盡空氣后熱封口。將巴斯德管至于高壓微生物培養釜中, 加壓至30.0 MPa, 28 ℃條件下培養30 d。30 d后分別取200 μL菌液測定OD600, 每個菌液3個重復。

1.4.3 復篩 根據初篩結果篩選出在低溫(4 ℃)、高壓(30.0 MPa)條件下生長顯著受限制的可疑突變子, 再根據初篩的步驟再次進行篩選, 每個樣本3個重復。

1.4.4 突變子重測序及比較基因組分析 篩選出對低溫、高壓敏感的突變子后, 采用細菌通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行PCR擴增, 獲得突變子的16S rRNA序列, 并在NCBI (National Center Biotechnology Information)網站上進行BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。提取突變子基因組DNA并進行重測序。采用高通量測序得到原始圖像數據文件, 經過轉化、過濾等處理得到Clean Data用于后續分析。測序數據上傳至NCBI的序列歸檔數據庫(Sequence Read Archive, SRA)。使用BWA (版本0.7.17)、SAMTOOLS (版本0.1.19)、Circos (版本0.69)以及BreakDancer (版本1.4.5)等軟件, 將測序數據與野生型基因組進行序列比對, 分析突變位點和片段信息[12-15]。利用直系同源蛋白簇數據庫(Clusters of Orthologous Groups of Proteins, COG)對變異基因進行注釋, 獲得突變基因。

2 結果與討論

2.1 突變子9-3E5具有低溫、高壓敏感性

對采用ARTP人工誘變處理后的突變子進行了低溫、高壓敏感性測試。結果表明, 突變子9-3E5在28 ℃條件下生長狀況良好, 但對于低溫、高壓條件較為敏感(圖1)。

以菌株生長達到穩定期時的OD600值作為菌株生長情況的判定標準。結果(圖1)顯示, 在28 ℃, 0.1 MPa條件下培養, 野生株YLB-01與突變子9-3E5均能較好生長, 9-3E5的OD600可達0.80；在28 ℃, 30.0 MPa(常溫高壓)條件下培養, 野生株YLB-01生長良好(OD600=0.50), 而突變子9-3E5生長明顯受限(OD600=0.15)；在4 ℃, 0.1 MPa (低溫常壓)條件下培養, 野生株YLB-01的OD600為0.25, 突變子9-3E5生長明顯受限(OD600=0.10)。野生株YLB-01在低溫和高壓條件下雖然生長會受到一定限制, 但仍能存活和生長, 即能夠耐受低溫和高壓極端環境；而對于突變子9-3E5, 無論是4 ℃的低溫條件還是30.0 MPa的高壓環境, 其生長量相較于野生型菌株YLB-01大幅減少, 幾乎不生長。

對應4 000～5 000 t銅陽極泥，年產浮選尾礦1 500～1 800 t，潛在的回收經濟價值為6 000余萬元。銅陽極泥浮選尾礦現處理工藝為返回銅冶煉艾薩系統處理，僅有銅冶煉煙塵開路，流程中不斷循環、富集的鉛、銻、鉍、碲對銅產品質量的控制存在隱患。同時，浮選尾礦中少量的貴金屬在銅冶煉流程中分散損失，這也影響了銅冶煉系統的金銀回收率。基于資源綜合回收的背景，銅陽極泥浮選尾礦中鉛、銻、鉍、碲的回收將具有長遠效益。

圖1 野生株YLB-01與突變子9-3E5常溫常壓、常溫高壓和低溫常壓環境下生長情況對比

2.2 突變子9-3E5與野生型的比較基因組分析

對突變子9-3E5進行了全基因組序列的重測序, 并與參考基因組序列(YLB-01)進行了比對分析。突變子9-3E5的16S rRNA基因擴增產物長為1 370 bp, 經BLAST比對, 與野生株(YLB-01)的相似度達99%, 表明突變子9-3E5來源于YLB-01。重測序基因組數據顯示, 突變子9-3E5基因組數據[NCBI登錄號(SRA)：SRR10828178]與野生型基因組(NCBI登錄號：CP038256)數據比對率達88.8%, 錯配率僅有0.5%。測序深度在基因組上分布均衡, 平均覆蓋度為228 bp；測序覆蓋度大于等于1X、4X、10X的區域占參考序列基因組的比例均在99.5%以上, 表示本次重測序覆蓋率高, 結果可信(表1)。

表1 樣品與參考序列的覆蓋度統計

2.3 突變子9-3E5的全基因組變異圖譜

使用Circos軟件結合測序Reads對參考序列的覆蓋情況和單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)、插入缺失標記(Insertion Deletion, InDel)進行分析, 以參考序列為標尺, 把Reads覆蓋情況和SNP、InDel的分布情況展示到環形的變異圖譜上[14]。圖2為突變子9-3E5全基因組變異圖譜, SNP和InDel在突變子全基因組上分布均勻，SNP突變率較高。

圖2 突變子9-3E5的全基因組變異圖譜

2.4 突變子9-3E5的SNP檢測

采用SAMTOOLS進行個體SNP的檢測[13]。結果顯示, 突變子9-3E5全基因組中共檢測到了1 082個SNP位點, 位點密度為0.39 SNP/kb。其中發生轉換的位點305個, 顛換的位點777個, 轉換位點數量不足顛換位點數量的二分之一, 轉換顛換率0.39。有182個SNP位點位于基因間區, 59個SNP位點位于編碼區且為同義突變, 838個SNP位點位于編碼區且為非同義突變, 編碼區非同義突變位點數量占總SNP數量的77.45%, 是同義突變位點數量的14.2倍。

2.5 突變子9-3E5的InDel檢測及注釋

基因組中小片段的插入或缺失若導致移碼突變將改變所編碼蛋白的結構與功能。采用SAMTOOLS軟件對小于50 bp的小片段的插入或缺失進行了檢測, 共檢測出了27個InDel, 其中有7個發生在基因間區。24個為插入突變, 3個為缺失突變, 在基因編碼區且發生移碼突變的共有11個InDel。

2.6 突變子9-3E5的SV類型個數及長度分布

用BreakDancer軟件[15]檢測了突變子9-3E5與參考基因組相比, 發生了插入、缺失、倒置、染色體內部遷移、染色體間的遷移的序列。結果顯示突變子9-3E5共有11條染色體結構變異(Structure Variation, SV)序列, 其中2條是染色體內部遷移, 9條是染色體間遷移。11條SV序列中, 長度在200～300 bp的序列占比為18.18%, 長度在300～400 bp的序列占比為81.82%。

2.7 突變子9-3E5 SNP和InDel變異富集

利用COG數據庫對細菌變異基因進行注釋分析, 共注釋到了23個分類(表2)。以OR(Odds Ratio)值>2、p<0.05 為富集標準, 富集到3個功能集：細胞周期調控、細胞分裂和染色體分裂功能集(OR值=2.419 0,p=0)；復制、重組和修復功能集(OR值=2.149 2,p=0)；胞內運輸、分裂和囊泡轉移功能集(OR值=2.506 5,p=0)。表明突變子9-3E5相對于野生株耐冷、耐壓性狀改變主要原因可能與細胞分裂、修復、胞內運輸等相關功能基因發生突變有關。

表2 突變子9-3E5 SNP和InDel變異富集結果

續表2

表3 9-3E5編碼區與富集的3個功能集相關基因的SNP突變統計

續表3

2.8 討論

突變子9-3E5與野生型菌株比較基因組分析提示, 細胞分裂、復制修復以及胞內運輸相關基因發生的突變可能是其相對于野生型菌株耐壓耐冷性狀改變的原因。

突變子9-3E5基因組中與細胞分裂、復制修復以及胞內運輸相關基因的突變主要有3種：一種是脯氨酸突變成其他氨基酸(如蘇氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺等), 這種突變由于脯氨酸一般位于蛋白轉角處, 所以突變發生后極有可能會改變其所編碼蛋白的結構[16]；一種是不帶電荷氨基酸突變成帶電荷氨基酸, 如不帶電甘氨酸突變成帶負電谷氨酸和堿性組氨酸突變成不帶電天冬酰胺, 這種突變可能會因為氨基酸所帶電荷的改變而影響蛋白的等電點；還有一種是極性氨基酸和非極性氨基酸之間的突變, 如極性絲氨酸突變成非極性異亮氨酸和極性甘氨酸突變成非極性纈氨酸, 這種突變可能會造成蛋白親水性的變化。這些突變極有可能改變蛋白的結構、等電點和親水性, 從而影響到蛋白的功能。

2.8.1 突變子與細胞分裂相關基因發生突變 細菌細胞的分裂過程同一系列的細胞分裂蛋白相關, 是一個較為復雜的過程[17]。有研究表明, 細菌在進行分裂前會有蛋白復合體產生為后續的分裂過程做準備。不同種屬細菌的細胞分裂蛋白復合體組分大致相同, 其基本組成為12個細胞分裂基本蛋白和15個輔助蛋白[18]。細菌細胞分裂涉及到的蛋白主要有FtsA、FtsB、FtsE、FtsI、FtsK、FtsL、FtsN、FtsQ、FtsW、FtsX、FtsZ等[17]。FtsA能夠形成原纖維絲[19]；FtsI參與肽聚糖的合成與細胞壁交聯[20-21]；FtsK是DNA移位酶； FtsN與隔膜形成有關[22-26]；FtsW是脂質翻轉酶，同時也是細胞壁前體細胞的跨膜轉運蛋白[27-28]；FtsZ主要功能是促進蛋白復合體骨架的形成, 并促進細胞收縮[29-31]。

通過對突變子9-3E5基因組數據分析, 有4個細胞分裂相關基因發生了非同義突變, 所編碼的蛋白分別為細胞分裂蛋白FtsI、FtsW、FtsX和細胞分裂起始蛋白。FtsI、FtsW、 FtsX以及細胞分裂起始蛋白的編碼基因發生突變, 極有可能影響了這些蛋白的結構或功能特性, 影響了細菌在極端環境下的分裂, 從而影響了突變子對于低溫、高壓環境的耐受性。閆文娟等(2013)的研究結果指出, FtsW在細菌處于熱應激時表達增高且主要由細菌的熱應激誘導[32]。我們在突變子中檢測到FtsW的編碼基因發生了突變, 極有可能影響了YLB-01在低溫環境下的細胞分裂, 從而改變了其低溫耐受性。但低溫耐受性的改變是否只與FtsW蛋白的突變的有關尚不能確定。菌株YLB-01對于高壓環境的耐受可能也與細胞分裂有關, 但具體是4種蛋白中的哪種或哪幾種的改變造成了其高壓適應性改變尚未能闡明, 還有待進一步的基因定點突變和回補實驗等進行驗證。

2.8.2 突變子與DNA修復、復制相關基因發生突變 生活在深海中的微生物, 其生命過程不可避免的要受到高壓這一嚴苛環境因素的影響。已有的研究表明高壓會影響到DNA氫鍵的穩定性, 同時也會造成DNA損傷[33]。DNA中氫鍵穩定性的提高會造成單鏈轉換為雙鏈需要的溫度升高, 影響到細胞內的轉錄、翻譯、修復等過程, 而深海(除熱液區外)又是典型的低溫環境，高壓與低溫同時存在無疑會對深海微生物的正常生命活動造成重大影響。突變子9-3E5的基因組中, 與細胞內DNA損傷修復相關的功能集共有6個突變基因, 涉及到10個非同義突變。

在大腸桿菌中, SOS反應是一種細胞對DNA損傷的應激反應, 目的是為了增加在不利環境條件下的存活率。DNA聚合酶III是由至少10個亞基組成的復合體, 而DNA聚合酶III的β亞基作為輔助蛋白, 功能是賦予聚合酶高催化活性和高加工性[34-36]；DNA復制/修復蛋白RecF對于DNA斷裂和缺口的重組修復十分重要,能促進dsDNA斷裂的重組修復[37-39]；易錯DNA聚合酶通過促進跨損傷DNA合成在細菌DNA損傷、耐受中發揮重要作用[40-44]; DNA回旋酶A亞基是在復制過程中將復制好的DNA雙鏈變為天然的負超螺旋的構型；ATP依賴性RNA解旋酶HrpA, 與翻譯起始、核糖體形成、前mRNA拼接和mRNA降解的許多進程都有著密切關聯；在嘌呤生物合成中, 氨基咪唑羧酰胺核肽(Aminoimidazole Carboxamide Nuclear Peptide, AICAR)是雙功能磷酸核糖氨基咪唑羧酰胺甲酰轉移酶/IMP環水解酶的底物[45]。這幾個與DNA損傷修復相關的基因發生了突變, 可能造成了9-3E5細胞在高壓下的DNA損傷無法正常修復；基因復制、翻譯相關基因發生突變, 表明細胞內的翻譯過程和核糖體的形成可能受到影響, 嘌呤的生成可能也受到了阻礙, 9-3E5細胞內DNA的正常復制過程受到了抑制, 從而對高壓低溫環境失去耐受性。結果提示, YLB-01的高壓和低溫環境耐受性可能與其細胞內的DNA損傷修復系統以及維持細胞內DNA復制翻譯過程的正常運行有關。

2.8.3 突變子與胞內運輸相關基因發生突變 突變子9-3E5的基因組中, 與胞內運輸相關的功能集有2個突變基因, 涉及到3個非同義突變。其一是糖磷酸轉移酶系統，在細胞內的功能主要是介導碳水化合物的吸收和磷酸化, 控制碳氮代謝以響應糖的供應[46-49]。另一個是葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉移酶系統, 主要和ATP的生成有關[50]。

細菌細胞內的代謝過程是其細胞內物質的消耗路徑, 細胞通過一系列的代謝過程將胞內的糖類、脂類、氨基酸等物質進行代謝消耗, 進而生成ATP以供應細胞的正常生命活動。富集到的胞內運輸功能集涉及的基因與代謝過程或能量生成相關, 這兩類基因發生突變可能意味著細胞內的代謝過程及能量生成過程受到影響, 提示我們YLB-01的低溫高壓耐受性可能與細胞內代謝途徑和能量生成途徑的調控有關。

3 結論

本實驗通過對一株耐冷、耐壓的深海沉積微桿菌M.sediminisYLB-01進行ARTP誘變, 得到了對低溫、高壓敏感的突變子9-3E5。對突變子進行了基因組重測序與突變情況分析。 結果表明, 突變子9-3E5低溫和高壓耐受性改變的原因可能是由于基因組中與細胞分裂、復制修復以及胞內運輸相關的基因發生了非同義點突變。相關基因發生突變對于YLB-01可能主要有以下3種影響：影響了細胞的正常分裂過程；在面對高壓帶來的DNA損傷時, DNA損傷修復以及正常的轉錄翻譯過程也受到了影響；細胞內的代謝過程和能量生成受到了調控。突變子9-3E5相對于野生型菌株YLB-01的這3點改變可能造成了其對低溫、高壓環境較為敏感。這也揭示M.sediminisYLB-01對于低溫和高壓環境的耐受性機制可能與細胞分裂過程、DNA損傷修復和復制翻譯過程、胞內運輸調控能量合成這3方面生命過程發生了改變有關。本研究為進一步闡明M.sediminisYLB-01的低溫高壓的適應性機制奠定了基礎。