鐵皮石斛豆腐柴螺二烯加氧酶基因克隆與表達分析

林江波，鄒 暉，王偉英，戴藝民

（福建省農業科學院亞熱帶農業研究所，福建 漳州 363005）

0 引言

【研究意義】植保素（Phytoalexin，又稱植物抗毒素）是一類具有物種特異性的小分子有機化合物，具有抗菌和驅蟲活性，受到病原菌或害蟲誘導產生[1]。目前已經鑒定的植保素主要有黃酮類、萜類、芪類、吲哚類、生物堿類和香豆素類等[2-3]。禾本科（Poaceae）植物主要產生二萜或黃酮類植保素[4-5]、豆科（Fabaceae）植物主要產生異黃酮類植保素[6]、茄科（Solanaceae）植物主要產生萜類植保素[7-8]。螺巖蘭草酮（Solavetivone）是一種倍半萜類植保素。豆腐柴螺二烯（Premnaspirodiene）合成酶催化法呢基二磷酸（FPP）環化形成豆腐柴螺二烯[9]，豆腐柴螺二烯在豆腐柴螺二烯加氧酶（Premnaspirodiene oxygenase）催化下，經過羥基化和氧化形成[10]螺巖蘭草酮。因此，豆腐柴螺二烯加氧酶是螺巖蘭草酮合成的關鍵酶。【前人研究進展】黃果茄（Solanum xanthocarpum）是一種重要的民間醫藥，具有殺蟲、抗菌[11-12]等功效，其根系提取的精油中，螺巖蘭草酮占22.9%[13]。DESJARDINS 等[14]研究發現，馬鈴薯（Solanum tuberosum）受到線蟲侵染后，抗病品種和感病品種根系的倍半萜烯含量變化不大，但是螺巖蘭草酮在倍半萜烯中的比例顯著提高。YAO 等[15]研究結果表明馬鈴薯試管苗用叢枝菌根菌（Glomus etunicatum）菌根化后受到立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染，根部螺巖蘭草酮和日齊素（Rishitin）含量顯著增加，通過培養皿生物測定，螺巖蘭草酮和日齊素抑制立枯絲核菌菌絲生長。KAWAUCHI[16-17]等用茉莉酸甲酯和硫酸銅處理天仙子（Hyoscyamus albus）毛狀根，會誘導合成螺巖蘭草酮及其衍生物，并克隆了螺巖蘭草酮合成酶基因豆腐柴螺二烯加氧酶基因（hahpo1）。【本研究切入點】鐵皮石斛（Dendrobium officinale）屬蘭科（Orchidaceae）石斛屬（DendrobiumSw.）藥用植物，具有增強免疫力、抑制腫瘤等功效[18-21]。目前，鮮見鐵皮石斛豆腐柴螺二烯加氧酶基因的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】本課題組從不同營養生長期鐵皮石斛葉片轉錄組測序數據中篩選差異表達基因時，獲得1 條帶5′末端的鐵皮石斛豆腐柴螺二烯加氧酶基因cDNA片段，根據cDNA 序列信息設計3′RACE 引物，利用RT-PCR 技術克隆基因全長cDNA 序列和ORF，分析豆腐柴螺二烯加氧酶基因在鐵皮石斛不同營養生長階段和開花期不同器官中的表達，以期為進一步鑒定基因功能及探討鐵皮石斛植保素的生物合成及抗病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 冠豸山鐵皮石斛開花期的根、莖、葉和花及8 月、10 月和12 月的葉片。

1.1.2 試驗試劑 寶生物工程有限公司的PrimeScriptTMReverse Transcriptase 和pMD19-T；湖南艾科瑞生物工程有限公司的SteadyPure植物RNA 提取試劑盒、2×Accurate Taq Master Mix（dye plus）和SYBR GreenPro TaqHS 預混型qPCR 試劑盒；測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 DoPO 基因克隆

根據轉錄組測序獲得的帶5′端的DoPO基因序列信息設計3′RACE、克隆開放閱讀框引物及3′RACE接頭引物，引物見表1，下同。由冠豸山鐵皮石斛葉片提取的總RNA 逆轉錄的單鏈cDNA 為模板進行PCR 擴增，PCR 產物經克隆后測序。

表1 PCR 引物及其序列Table 1 PCR primers and sequences

1.3 生物信息學分析

利用BLAST P 在GeneBank 中搜索DoPO 氨基酸序列相似性和保守結構域。利用ProtParam 預測DoPO 蛋白的理化性質。系統進化分析（Neighbor Joining Tree,Bootstrap 1 000）和進化樹構建由MEGA 6.0 軟件完成[22]。

1.4 DoPO 基因表達分析

按照SteadyPure植物RNA 提取試劑盒的說明提取各樣品的RNA，用PrimeScriptTMReverse Transcriptase逆轉錄成cDNA，濃度定量為200 ng·μL-1。設計qPCR引物PO-F 和PO-R，擴增長度為149 bp。Actin基因屬于持家基因，在細胞中組成型表達，常用于基因表達分析的內參基因。選擇鐵皮石斛Actin作為內參基因，引物為DoACT-F 和DoACT-R，產物長度為215 bp。實時熒光定量PCR 參考林江波等的方法[23]。

2 結果與分析

2.1 DoPO 基因的3′RACE 克隆

用隨機引物反轉錄的cDNA 為模板，用引物3PO-1 和dT-Adpt、引物3PO-2 和Adpt 先后進行二輪PCR，電泳結果見圖1A，在500 bp 左右有1 條特異性條帶。膠回收目的片段，經過克隆和測序后，用DNAMAN V6.0 對3′-RACE 的測序結果進行序列拼接和ORF 的分析。結果表明獲得DoPO基因cDNA全長，長度為1 704 bp (圖2)，含1 個編碼498 個氨基酸的完整閱讀框架，5′末端非翻譯區40 bp，3′末端非翻譯區167 bp。

圖1 PCR 電泳結果Fig.1 PCR products by electrophoresis

圖2 鐵皮石斛DoPO 基因cDNA 序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 Sequences of cDNA and its deduced amino acids of DoPO from D.officinale

2.2 DoPO 基因ORF 克隆

以隨機引物反轉錄的鐵皮石斛葉片cDNA 為模板，利用引物DoPO-F 和DoPO-R 進行PCR 擴增，PCR 產物電泳結果（圖1B）顯示，在1 532 bp 處有1 條特異性條帶。PCR 產物經過克隆和測序，結果表明：獲得了帶BamH I 和XhoI 酶切位點的DoPO基因ORF。提取質粒pMD19-T-DoPO，－20℃保存。

2.3 生物信息學分析

DoPO 蛋白的分子量為56.914 kD，屬不穩定蛋白。使用BLAST P 檢索DoPO 蛋白保守結構域和同源序列，結果表明：DoPO 蛋白屬于p450 超級家族，氨基酸序列與姬蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris,XP 020571355）、深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica,PKA52400）和埃及莨菪（Hyoscyamus muticus,A6YIH8）的PO 氨基酸相似度分別為85%、76%和70%。將DoPO 與其他15 個物種的PO 氨基酸序列進行系統進化分析，結果表明（圖3）：16 個物種聚為4 大類，鐵皮石斛與蘭科植物的姬蝴蝶蘭（XP 020571355）和深圳擬蘭（PKA52400）聚為一類，與姬蝴蝶蘭親緣關系最近；棕櫚科的海棗（Phoenix dactylifera,XP_038978059）和油棕（Elaeis guineensis,XP_010910607）聚為一類；茄科植物的埃及莨菪（Hyoscyamus muticus,A6YIH8）、天仙子（Hyoscyamus albus,BAN58140）、馬鈴薯（Solanum tuberosum,NP_001305614）、潘那利番茄（Solanum pennellii,XP_015072942）和番茄（Solanum lycopersicum,XP_004237369）聚為一類。

圖3 不同物種豆腐柴螺二烯加氧酶的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of premnaspirodiene oxygenase from different species

2.4 DoPO 基因在不同器官的表達

以Actin基因作為內參基因，qRT-PCR 檢測DoPO基因在鐵皮石斛開花期不同器官的表達，結果表明（圖4），花、莖、葉和根都能檢測到DoPO基因的表達，表達量的高低依次為葉＞花＞根＞莖，而且表達量存在極顯著差異。

圖4 DoPO 基因在不同器官的表達Fig.4 Expression of DoPO in various organs

2.5 DoPO 基因在不同營養生長期葉中的表達

為了進一步分析DoPO基因在鐵皮石斛不同營養生長階段葉片中的表達模式，利用熒光定量PCR 技術分析了鐵皮石斛葉片DoPO基因在8、10、12 月份的表達情況，結果表明（圖5）：10 月份的表達量最高，與8、12 月份的差異極顯著。其次是12 月份，與8 月份的差異顯著。

圖5 DoPO 基因在葉中的相對表達量Fig.5 Relative expression of DoPO in leaves

3 討論與結論

豆腐柴螺二烯加氧酶是植物合成植保素螺巖蘭草酮的關鍵酶。TAKAHASHI 等[10]克隆了埃及莨菪的HPO基因，其編碼蛋白屬于P450 超級家族成員，體外酶活性實驗表明，具有催化豆腐柴螺二烯形成螺巖蘭草酮的活性；此外，還可以催化幾種艾里莫芬烷型（十氫化萘環系統）倍半萜烯C-2 的羥基化。細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶是一類血紅素蛋白類酶，具有氧化、羥基化和去甲基化等多種催化活性[24]，如果氨基酸序列一致性高于40%屬于同一個家族，高于55%則屬于同一個亞家族[25]。本研究克隆了鐵皮石斛的DoPO基因，屬于P450 超級家族，核苷酸序列與埃及莨菪HPO（A6YIH8）的氨基酸相似度為70%，屬同一亞家族，推測DoPO具有催化豆腐柴螺二烯形成螺巖蘭草酮的活性。

植保素一般在病原菌或害蟲侵害后幾個小時開始形成和累積[26]，是植物對抗病原菌、害蟲等侵害的一種防御機制[27-28]。KAWAUCHI 等[16]克隆了天仙子的hahpo1 基因，茉莉酸甲酯處理后24 h、茉莉酸甲酯和硫酸銅共同處理后6 h 能檢測到hahpo1 基因的表達，未處理沒有檢測到表達。本研究發現鐵皮石斛DoPO基因在葉、莖、根和花中都有表達，但葉的相對表達量最高，莖的相對表達量最低，葉片DoPO基因的相對表達量又以10 月份最高。從鐵皮石斛DoPO基因表達模式來看，在整個生長期，各器官可能都有合成一定量的螺巖蘭草酮，這需要通過檢測各器官的螺巖蘭草酮含量來進一步驗證。

本研究克隆了鐵皮石斛DoPO基因，分析了其在不同器官和營養生長期葉片的表達模式，為進一步研究其催化功能和探討鐵皮石斛植保素的生物合成及抗病機制奠定基礎。