長期施用沼液對土壤中四環素類及磺胺類抗性基因分布的影響

劉蘭英，黃 薇，呂 新，何肖云，陳麗華，宋永康

（福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/福建省農產品質量安全重點實驗室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】沼液中含有豐富的營養元素、氨基酸、B 族維生素和植物生長素等生理活性物質[1]，將沼液作為有機肥料施用于農業土壤，可以為作物生長提供充足的養分需求，同時也是處理畜禽養殖廢棄物的主要途徑之一。但畜禽養殖過程投入的大量抗生素只有少部分被動物吸收，大部分最終會殘留在沼液中，而隨著沼液的還田利用，部分抗生素也隨之進入土壤環境中[2]。土壤中抗生素的積累可能會誘導微生物產生抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes,ARGs），造成ARGs 的傳播擴散[3]。研究表明，ARGs 能在環境中持久性殘留，其污染風險可能要比抗生素本身的風險更大[4]。因此，研究沼液施用到土壤后對土壤ARGs 的影響，對于進一步評估沼液還田的安全性具有很重要的意義。【前人研究進展】目前，關于糞肥施用對農田土壤中ARGs 影響的報道較多。Peng 等[5]發現長期的豬糞施用顯著增加了土壤中ARGs 的多樣性，豬糞處理的土壤比施用牛糞土壤含有更豐富的ARGs。Li 等[6]發現長期的牛糞和雞糞施用均顯著增加了溫室土壤中抗生素和ARGs 的殘留水平，抗生素濃度與ARGs 豐度顯著正相關。Zhao 等[7]發現長期的雞糞施用顯著提高了農田土壤中ARGs 的豐度水平。McKinney 等[8]發現牛糞的施用顯著增加了土壤中ARGs 的豐度，且ARGs 豐度會隨土壤施肥量增加而增加。【本研究切入點】然而，在眾多研究中，對于沼液施用對土壤中ARGs的影響及其季節變化方面的研究較少。唐鵬[2]報道了沼液施用對橡膠人工林土壤抗生素殘留的影響，但并未涉及ARGs 方面的研究。【擬解決的關鍵問題】本研究選取養豬場周邊長期施用沼液的土壤為研究對象，同時采集當地未施用過沼液的土壤作為對照，采用熒光定量PCR 方法，對土壤中常見的14 種四環素類ARGs（tetA、tetB、tetC、tetG、tetH、tetK、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW、tetY、tetZ）和3 種磺胺類ARGs（sul1、sul2、sul3）進行檢測，分析長期施用沼液對土壤中ARGs 多樣性和豐度的影響，并探討其季節分布特征，以期為沼液的安全農用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 采樣點基本情況

土壤樣品采集于建甌市某養豬場糞污處理沼氣工程周邊的農田（27°13.30′N，118°12.80′E），已持續施用該養豬場沼液6 年。該養豬場目前生豬存欄數2 500 頭，生豬生產區及污水處理區占地面積約6 hm2，豬場污水日排放量約30 m3·d-1。施肥用沼液是由沼氣工程充分發酵后經氧化塘處理的液體（沼液與氧化塘的水配比為1∶2）。供試沼液基本理化性質為：pH 7.99，化學需氧量（COD）285 mg·L-1，五日生化需氧量（BOD5）263 mg·L-1，氨氮475 mg·L-1，總氮978 mg·L-1，總磷22.50 mg·L-1。采樣點土壤質地為砂壤土，主要種植作物為檳榔芋，每年只種1 季，3 月中下旬種植，11 月初收獲，冬季閑田。沼液灌溉的田塊按照基肥和追肥方式灌入，在檳榔芋種植前，每667 m2灌入沼液量約15 t，與田土混勻作基肥；隨后每隔15 d 進行1 次追肥，每次追肥灌入沼液量約6 t，大概8 月下旬進行最后1 次追肥，整個生長期都不施用其他肥料。其他農藝管理措施均按照當地常規習慣統一實施。

1.2 樣品采集與制備

分別于2019 年5 月（春季）、7 月（夏季）、10月（秋季）和2020 年1 月（冬季），在檳榔芋種植地塊上進行根際土壤樣品的采集，其中春季和夏季的取樣時間均為下一次沼液施入的前兩天。采樣時除去表層枯枝落葉等雜物，用取土器沿著植株的根部采集0～20 cm 土層的土壤樣品，標記為BS+，同時采集周邊一處地勢較高未施用過沼液的檳榔芋土壤作為對照樣品，標記為BS-，這兩塊檳榔芋田同屬于一個農戶，種植方式和田間管理方式相同。每塊樣地設置3 份重復，每份重復樣品均由五點取樣法獲得5 個小樣組成，現場混合均勻后裝入無菌塑封袋中，放入帶有冰塊的保溫箱中運回實驗室，-80 ℃冷凍保存待測。

1.3 土壤基因組DNA 提取

采 用TIANamp Soil DNA Kit（TIANGEN，北京）試劑盒，參照說明書，對土壤微生物總DNA 進行提取，將提取的DNA 用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳，使用超微量分光光度計（Quawell Q3000，美國）檢測其濃度和純度。

1.4 土壤ARGs 測定

采用StepOnePlus? Real-Time PCR System（ABI，美國）實時熒光定量反應平臺，對土壤中14 種四環素類ARGs（tetA、tetB、tetC、tetG、tetH、tetK、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW、tetY、tetZ）、3 種磺胺類ARGs（sul1、sul2、sul3）及16S rRNA 基因進行qPCR 檢測和定量分析，其中四環素類ARGs 和16S rRNA 基因所用引物參考Zhu 等[9]，磺胺類sul1和sul2 基因所用引物參考Lu 等[10]，sul3 基因參考Xiong 等[11]。qPCR 擴增體系參照TB Green? Premix Ex Taq? II（Takara，日本）試劑盒說明書，10 μL 的qPCR體系包括5.0 μL 的TB Green Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus）（2×），0.4 μL 的上下游引物（10 μmol·L-1），0.2 μL 的ROX Reference Dye（50×），1.0 μL 的DNA 模板，ddH2O 補充體積至10 μL。擴增條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，擴增40 個循環。每個樣品設3 個平行，以無菌水作為陰性對照，3 個平行均被擴增出來即為有效擴增。

1.5 土壤ARGs 相對豐度計算

選取16S rRNA 基因為參比基因，采用△Ct 方法計算土壤樣品中ARGs 的相對豐度，具體計算公式如下[12]：

式中，Ct（ARG）為目標基因的熒光信號達到設定閾值時所需的循環數；Ct（16S rRNA）為參比基因的熒光信號達到設定閾值時所需的循環數；F 值為相對豐度。

1.6 數據分析

采用Microsoft Excel 2007 和SPSS Statistics 13.0軟件對數據進行統計分析，并采用Duncan 檢驗對不同樣品進行差異性分析（P＜0.05），柱形圖通過OrginPro 2015 軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 不同季節土壤中ARGs 的多樣性

不同季節土壤樣品中14 種四環素類ARGs（tet）和3 種磺胺類ARGs（sul）的檢測結果如表1 所示。從表1 可以看出，在17 種目標ARGs 中，長期施用沼液的土壤樣品中可以檢出11～13 種ARGs，其中磺胺類ARGs 的檢出率達到100%，檢測到的四環素類ARGs 主要包括5 種編碼外排泵的基因（tetB、tetG、tetH、tetY、tetZ）和6 種編碼核糖體保護蛋白的基因（tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW）。在未施用沼液的土壤樣品中檢出6～7 種ARGs，磺胺類ARGs 的檢出率也達到了100%，但檢測到的四環素類ARGs 僅有3～4 種（tetB、tetG、tetY、tetZ）。

表1 不同季節土壤中檢測到的抗性基因（n=3）Table 1 Resistance genes detected in the soils in different seasons

長期施用沼液土壤樣品中的ARGs 多樣性在季節之間波動較明顯，4 個季節土壤樣品的ARGs 多樣性表現為春季＞冬季＞夏季＝秋季，春季明顯高于夏季和秋季。未施用沼液土壤樣品中一年四季的ARGs多樣性變化不大，僅在秋季略有下降。總體而言，長期施用沼液比未施用沼液土壤在各季節均有更高的ARGs 多樣性，說明長期施用沼液明顯增加了土壤中ARGs 的多樣性。

2.2 不同季節土壤中四環素類ARGs 的相對豐度

通過計算不同季節土壤中四環素類ARGs 總和（sumtet）的相對豐度，比較了土壤中四環素類ARGs 的存在水平，結果如圖1 所示。

從圖1 可以看出，長期施用沼液的土壤中sumtet的相對豐度均在10-4數量級，未施用沼液的土壤中sumtet的相對豐度在10-5～10-4數量級。長期施用沼液土壤中四環素類ARGs 總和的相對豐度，均顯著高于未施用沼液土壤中相應ARGs 總和的相對豐度（P＜0.05），表明長期施用沼液會增加土壤中四環素類ARGs 的存在水平。從季節上來看，在長期施用沼液的土壤中，春季四環素類ARGs 總和的相對豐度顯著高于其他3 個季節（P＜0.05）。對于未施用沼液的土壤，四環素類ARGs 在春季也呈現出較高的相對豐度。

圖1 不同季節土壤中四環素類ARGs 相對豐度總和Fig.1 Sum of relative abundance of tetracycline ARGs in soil specimens collected in different seasons

進一步統計了長期施用沼液和未施用沼液土壤中同時檢測到的tetG、tetY 和tetZ 等基因的相對豐度，結果如圖2 所示。從圖2 可以看出，施用過沼液和未施用過沼液土壤中tetG、tetY 和tetZ 基因的相對豐度分別在10-6～10-4、10-7～10-6和10-6～10-5數量級，表明采集的所有土壤中都有著豐富的tetG和tetZ 基因。與未施用沼液土壤相比，長期施用沼液土壤中tetG 基因的相對豐度基本顯著增加，而tetY 基因的相對豐度則顯著減少（秋季除外），說明長期施用沼液能夠提高土壤中微生物攜帶tetG 基因的水平。經過連續6 年的沼液施肥，土壤中tetZ 基因的相對豐度與未施用沼液土壤相比無顯著差異（P＞0.05），表明該基因的相對豐度沒有受到沼液施用的顯著影響。從季節上來看，在長期施用沼液的土壤中，tetG 基因在春季土壤中的相對豐度要顯著高于其他3 個季節（P＜0.05），而tetY 和tetZ 基因的相對豐度在不同季節之間均無顯著差異。對于未施用沼液的土壤，tetG 和tetY 基因在春季也都呈現出較高的相對豐度，而tetZ 基因的相對豐度在不同季節之間無顯著差異，表明該基因的相對豐度沒有受到季節的顯著影響。

圖2 不同季節土壤中四環素類ARGs 的相對豐度Fig.2 Relative abundance of tetracycline ARGs in soil specimens collected in different seasons

在長期施用沼液土壤中還檢測到tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW 等編碼核糖體保護蛋白的基因（圖3），其相對豐度在10-7～10-4數量級，這些基因在未施用沼液的土壤中未能檢出。從圖3 可以看出，在春季和秋季，各基因的相對豐度排序為tetM＞tetW＞tetO＞tetQ＞tetT，tetS 基因未檢出；在夏季，各基因的相對豐度排序為tetM＞tetO＞tetW＞tetQ＞tetT，tetS 基因未檢出；在冬季，各基因的相對豐度排序為tetM＞tetO＞tetW＞tetQ＞tetS，tetT 基因未檢出。可見，tetM、tetO 和tetW 基因在不同季節長期施用沼液土壤中都呈現出較高的相對豐度，其中tetM 基因的相對豐度在10-5～10-4數量級，tetO 和tetW 基因的相對豐度在10-5數量級，說明這3 種核糖體保護蛋白基因在長期施用沼液土壤中的存在水平比其他基因更高。方差分析結果顯示，tetM和tetW 基因在春季土壤中的相對豐度要顯著高于其他3 個季節，tetO 基因在夏季土壤中的相對豐度要顯著高于其他3 個季節（P＜0.05）。

圖3 長期施用沼液的土壤中四環素類ARGs 的相對豐度Fig.3 Relative abundance of tetracycline ARGs in soils with long-term application of biogas slurry

2.3 不同季節土壤中磺胺類ARGs 的相對豐度

通過計算不同季節土壤中磺胺類ARGs 總和（sumsul）的相對豐度，比較了土壤中磺胺類ARGs 的存在水平，結果如圖4 所示。

圖4 不同季節土壤中磺胺類ARGs 相對豐度總和Fig.4 Sum of relative abundance of sulfonamide ARGs in soil specimens collected in different seasons

從圖4 可以看出，長期施用沼液的土壤中sumsul的相對豐度在10-4～10-3數量級，未施用沼液的土壤中sumsul的相對豐度在10-5～10-4數量級。長期施用沼液土壤中磺胺類ARGs總和的相對豐度，均顯著高于未施用沼液土壤中相應ARGs 總和的相對豐度（P＜0.05），表明長期施用沼液會增加土壤中磺胺類ARGs 的存在水平。從季節上來看，在長期施用沼液的土壤中，磺胺類ARGs 總和的相對豐度呈現春季＞夏季＞秋季＞冬季的趨勢，春季的相對豐度顯著高于其他季節（P＜0.05）。對于未施用沼液的土壤，磺胺類ARGs 的相對豐度在季節間的波動沒有明顯的規律，但在春季也呈現出較高的相對豐度。

進一步統計了各土壤樣品中不同種磺胺類ARGs的相對豐度，其季節分布特征如圖5 所示，可以看出，在分析的3 種磺胺類ARGs 中，sul1 和sul2 基因在各季節土壤中的相對豐度普遍高于sul3 基因，表明采集的所有土壤中都有著豐富的sul1 和sul2 基因。與未施用沼液土壤相比，長期施用沼液土壤中sul1 和sul2 基因的相對豐度都顯著增加，這2 種基因在施用沼液土壤中的相對豐度均達到了10-4數量級水平，說明長期施用沼液能夠提高土壤中微生物攜帶sul1 和sul2 基因的水平。從季節上來看，在長期施用沼液的土壤中，sul2 基因在春季土壤中的相對豐度比在其他3 個季節高出1 個數量級，差異達到顯著性水平（P＜0.05）；夏季sul3 基因的相對豐度顯著高于其他3 個季節。對于未施用沼液的土壤，sul1、sul2 和sul3 基因均在春季土壤中具有更高的相對豐度。

圖5 不同季節土壤中磺胺類ARGs 的相對豐度Fig.5 Relative abundance of sulfonamide ARGs in soil specimens collected in different seasons

3 討論

在ARGs 多樣性分析中，發現在未施用沼液的土壤樣品中同樣能檢測到一些ARGs，包括tetB、tetG、tetY、tetZ、sul1、sul2 和sul3，這些ARGs 都存在于長期施用沼液的土壤樣品中，說明這些ARGs 在土壤中廣泛存在，可能是土壤中的背景ARGs，也可能是污染殘留造成的。Knapp 等[13]研究發現在無抗生素污染歷史的土壤中就已經存在四環素類、β-內酰胺類和大環內酯類ARGs；Brion 等[14]調查發現，在使用抗生素前的土壤樣本中同樣能檢測到tetC 等四環素類ARGs。Tang 等[15]對稻田土壤的研究也發現不施糞肥土壤中ARGs 的存在。以上研究均表明土壤環境中本身就存在一定濃度的ARGs，這些ARGs可能是由土壤中固有的抗生素抗性微生物所攜帶的。相關研究表明，土壤中的一些土著微生物為了能夠更好地適應環境，自身會產生低濃度的抗生素以抵制競爭者的生存[16]。

分析沼液施用后土壤中ARGs 的變化情況，發現與未施用沼液的土壤相比，長期施用沼液的土壤中具有更高的ARGs 多樣性，檢測出了7 種后者不具有的ARGs，包括tetH、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT 和tetW，這些ARGs 可能是由沼液帶入土壤的外源抗性基因。有研究指出，tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW 等四環素類ARGs 在畜禽糞便中較為常見[17-18]。根據定量分析結果可知，與未施用沼液的土壤相比，長期施用沼液后土壤中四環素類和磺胺類ARGs的總豐度呈顯著增加的趨勢（P＜0.05），表明長期沼液的施用顯著提高了土壤中ARGs 的整體存在水平。這種增加可能是由于沼液提供的養分引起土壤中某些攜帶四環素類或磺胺類ARGs 微生物的大量繁殖，也有可能是沼液中攜帶的ARGs 及抗性微生物在土壤中的存活和繁殖引起的。Han 等[19]研究表明，施用動物糞肥通過影響土壤的理化特性，改變土壤中的細菌數量，進而影響土壤中ARGs 的存在水平。大量研究也表明，有機肥的施用會增加農田土壤中ARGs 的多樣性和豐度[9,20-21]。然而，本研究發現長期施用沼液土壤中tetY 和sul3 基因在個別季節的相對豐度并沒有高于未施用沼液土壤，tetZ 基因受到沼液施用的影響相對較小。這可能與土壤中宿主微生物數量的消長以及基因發生水平轉移有關；此外，不同ARGs 之間或許存在互補作用，某一類ARGs 豐度的增加也可能伴隨著另一類ARGs 豐度的減少同時發生[22]。

分析不同季節土壤中ARGs 的分布情況，發現在長期施用沼液的土壤中，tetG、tetM、tetQ、tetW 和sul2 等基因的相對豐度具有明顯的季節特點，表現出春季的相對豐度要顯著高于其他3 個季節（P＜0.05）的趨勢，尤其sul2 基因在春季土壤中的相對豐度比在其他3 個季節高出1 個數量級。在未施用沼液的土壤中，檢測到的tetG、tetY、sul1、sul2 和sul3 等基因的相對豐度在季節之間波動更明顯，但季節之間所呈現出的規律與長期施用沼液土壤相類似，都在春季土壤中具有更高的相對豐度。總體而言，春季各土壤樣品中四環素類ARGs 總和與磺胺類ARGs總和的相對豐度均要高于其他季節土壤。這可能是由于春季的氣候條件更適合土壤中tetG、sul2 等基因宿主細菌的生存，進而導致四環素類和磺胺類ARGs的總豐度在春季更高。張俊等[23]在研究長期施用四環素殘留豬糞的土壤樣本中發現，適宜的氣候條件對耐藥菌及ARGs 的生成具有很好的促進作用，但該研究指出秋季涼爽的氣候更適合土壤中ARGs的生成。也有相關研究表明，冬季較低的氣溫減緩了抗生素在土壤環境中的降解，加上冬季養殖場為預防疫病而加大了抗生素的使用量，導致冬季土壤中ARGs 豐度更高[24]。而本研究發現，除了春季，不同ARGs 在其他季節之間并沒有一致的變化規律，關于季節對土壤中不同ARGs 形成的影響機制仍需進一步長期的跟蹤調查。

分析土壤中各種目標ARGs 的分布情況，發現四環素類的2 種ARGs（tetG 和tetZ）與磺胺類的2 種ARGs（sul1 和sul2），在不同季節長期施用沼液和未施用沼液土壤樣品中都占據較高的比例，屬于優勢ARGs。此外，tetM、tetO 和tetW 基因也在長期施用沼液的土壤中占據較高的比例，其中tetM 基因達到10-5～10-4數量級水平，tetO 和tetW 基因在10-5數量級水平。樓晨露[24]在研究長期施用豬糞的稻田土壤中發現，磺胺類ARGs 中sul1 和sul2 基因的相對豐度較高，介于10-4～10-3數量級水平，與本研究長期施用沼液土壤中相應基因的豐度水平相當；四環素類ARGs 中tetG 基因的豐度最高，介于10-4～10-3數量級水平，高于本研究（10-5～10-4數量級水平）。彭雙等[22]在研究連續施用豬糞的稻麥輪作土壤中也發現，在施用豬糞土壤中tetG 基因的相對豐度最高（接近10-2數量級水平），其次是tetZ 基因（10-3數量級水平），均高于本研究（圖2）。相關研究也表明，四環素類ARGs 中tetM、tetO、tetW 基因在養豬場排泄物及周邊土壤中大量存在[25]。以上研究表明，四環素類ARGs 中tetG、tetZ、tetM、tetO 和tetW 基因與磺胺類ARGs 中sul1 和sul2 基因在土壤中的傳播風險高于其他ARGs，因此養殖場仍需優化發酵工藝以降低糞肥農用帶來的ARGs 污染風險。

4 結論

（1）長期施用沼液使土壤中ARGs 的多樣性增加，在所分析的17 種目標ARGs 中，tetG、sul1 和sul2 基因的相對豐度基本顯著增加，土壤中四環素類和磺胺類ARGs 的整體相對豐度均明顯提高，因此沼液農用前的ARGs 污染水平評價顯得尤為重要。

（2）四環素類和磺胺類ARGs 在土壤中的存在水平具有明顯的季節特點，兩類ARGs 總豐度在春季土壤中更高，春季長期施用沼液和未施用沼液土壤中都有著豐富的tetG 和sul2 基因，關于季節對土壤中ARGs 形成的影響機制仍需進一步探究。

（3）在所分析的17 種目標ARGs 中，tetG、tetZ、tetM、tetO、tetW、sul1 和sul2 基因在長期施用沼液的不同季節土壤中均大量存在，為土壤中的優勢ARGs，未來需加強優化畜禽廢棄物發酵工藝，以削減ARGs 帶來的污染風險。