杏鮑菇528深層發酵生物合成麥角硫因的培養基優化

湯葆莎，吳 俐，翁敏劼，賴譜富，李怡彬

[1.福建省農業科學院農業工程技術研究所，福建 福州 350003；2.福建省農產品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350003]

0 引言

【研究意義】麥角硫因（L-Ergothioneine,EGT）是自然界存在的一種小分子含硫化合物，也是一種結構及功能獨特的天然稀有手性氨基酸。該化合物最初在麥角菌（Claviceps purpurea）中被發現，作為細胞生理保護劑在人體內對細胞有高度保護作用，有清除自由基、解毒、維持DNA 生物合成和細胞正常生長等多種生理功能[1-3]，在食品、醫藥和化妝品等行業具有廣泛的應用前景。利用食用菌液體深層發酵生產麥角硫因，具有生產成本低、易于工業化連續生產、產品安全等優點，是生物合成麥角硫因的發展方向?！厩叭搜芯窟M展】食用菌中含有EGT 且可用不同制備方法獲取已被學者證實。BAO H N D 等[4]從金針菇（Flammulina velutipes）子實體中提取到EGT，NANCY J D[5]從固態發酵培養的雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）菌絲體中提取到EGT，TEPWONG P 等[6]從液體發酵培養的香菇（Lentinus edodes）菌絲體中提取到EGT。STAMPFLI A R 等[7]、劉琦等[8]和VALACHOVá K 等[9]通過對EGT 不同制備方法比較后指出，生物發酵合成是低成本、規?；aEGT的主要模式，利用食用菌菌絲體液體發酵制備EGT是種較好的產業化生產方式，但仍有必要進一步研究如何提高食用菌菌絲體深層發酵液中的EGT 含量。為此，眾多學者嘗試通過對食用菌深層發酵過程中的營養代謝調控研究來提高其發酵物EGT 產率。TEPWONG P等[10]研究了香菇菌絲體深層發酵液中添加不同碳源對菌絲體EGT 含量的影響，結果表明果糖可顯著提高其菌絲體中的EGT 含量；LEE W Y等[11]研究了紫黑靈芝（Ganoderma neo-japonicum）菌絲體深層發酵液中添加不同氨基酸對菌絲體EGT 含量的影響，結果表明蛋氨酸（Met）或半胱氨酸（Cys）可顯著提高其菌絲體EGT 含量。研究證實，人們可以通過調控食用菌菌絲體深層發酵液中的碳氮源、氨基酸種類來影響微生物發酵過程中的EGT 含量。杏鮑菇（Pleurotus eryngii）是集食用、藥用于一體的食用菌，研究證實通過深層發酵培養獲得的菌絲體，其營養價值與室內菌袋層架栽培的子實體相當[12-13]，但其中的EGT 含量仍處在較低水平[10]。為有效提高杏鮑菇深層發酵液中的EGT含量，有必要通過碳氮源、氨基酸等營養控制手段來調控微生物發酵過程以提高EGT 產量。近年來，LIN S D 等[14]在研究杏鮑菇菌絲體深層發酵液的品質特性時發現，杏鮑菇菌絲體及發酵液中均含有一定量的EGT，進而提出需進行發酵產物全利用以提高杏鮑菇深層發酵EGT 產率?！颈狙芯壳腥朦c】但基于提高杏鮑菇深層發酵液中EGT 產率的培養配方鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】因此，本文以提高杏鮑菇528 深層發酵物中EGT 含量為指標，研究不同碳氮源對杏鮑菇528 固體培養平皿菌絲生長的影響，探討玉米糝粉和蛋白胨對杏鮑菇528 深層發酵菌絲生長的影響，再比較分析不同氨基酸對杏鮑菇528 液體培養發酵物麥角硫因含量的影響，最后依據EGT 含量來設計提高杏鮑菇528 發酵物麥角硫因含量的深層發酵營養配方，以解決目前杏鮑菇深層發酵菌絲體EGT 含量偏低的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇528 菌種為福建省農業科學院食用菌研究所提供。試驗所需的碳氮源、氨基酸以及其他試劑均購于試劑公司，化學試劑均為分析純。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 發酵物干重檢測 采用真空冷凍干燥法，設置干燥流程為：-20 ℃ 1 h、-5 ℃ 2 h、20 ℃ 2 h、60 ℃至樣品完成干燥。具體操作方法為：將試驗結束后的樣品-發酵物倒于可供冷凍干燥的器皿中，置于-40 ℃冰箱中預冷5～10 h 后，于真空冷凍干燥機（SCIENTZ-30ND，寧波新芝生物科技股份有限公司）中冷凍干燥24 h，取出已干燥的發酵物置于干燥皿中，使用電子天平稱量并記錄后，分裝于樣品袋內。

1.2.2 麥角硫因含量檢測 參考姜文俠[15]的方法進行檢測，檢測儀器為Waters e2695 型高效液相色譜儀。

色譜分析條件：Sunfire C18 150×4.6 mm 3.5 μm液相色譜柱；流動相為乙腈-水（3∶97）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

標準品溶液配制：配制不同濃度（0.1 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、15.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1）的標準品稀釋液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液進樣檢測并繪制標準曲線。

供試品溶液配制：稱取粉碎后的凍干杏鮑菇528 發酵物樣品0.5 g，加入甲醇10 mL，攪拌均勻后用數控超聲波清洗器（KQ-600DV，昆山市超聲儀器有限公司）超聲處理20 min，中性濾紙過濾后用針筒吸取上清液1 mL，再用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液即為供試品溶液。上機檢測麥角硫因含量。

1.3 試驗設計

1.3.1 杏鮑菇528 菌絲生長碳氮源的篩選 為了解杏鮑菇528 菌絲生長習性，試驗以固體平皿培養的方式來進行菌絲生長的適宜碳氮源篩選。固體平皿培養的基礎培養基為：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%（PDA 培養基），選?。浩咸烟恰Ⅺ溠刻?、蔗糖、乳糖和玉米糝粉作為待篩選碳源，玉米漿、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作為待篩選氮源，培養基中各篩選碳氮源的比例皆為2%。培養基配制好后，于121 ℃高壓滅菌20 min，待培養基冷卻至50 ℃左右，將培養基倒入90 mm 平皿中，每個處理設計3 次重復。培養基冷卻凝固后接入直徑4～5 mm 的杏鮑菇528 菌塊，置于25 ℃培養箱內遮光培養9 d。菌絲萌發2 d 后，開始觀察菌絲生長情況，采用十字交叉法，每天測量菌落直徑，以菌絲長滿平皿的時間和菌絲形態來綜合判斷杏鮑菇528 固體培養菌絲生長的適宜碳氮源。

1.3.2 杏鮑菇528 深層發酵培養碳氮源比例的篩選根據1.3.1 確定的最佳碳氮源，來設計杏鮑菇528 深層發酵培養配方，碳氮源的比例均定為1.0%、2.0%、3.0%，配方其他成分為：麥麩細粉1.0%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、谷氨酸0.1%和維生素B60.1%，每處理設置3 次重復。配制后培養液于燒杯中觀察沉淀物情況，沉淀物情況以“+”表示（“+”越多表示沉淀物情況越嚴重），再檢測初始pH 值；將培養液分裝于250 mL 三角瓶中（100 mL/瓶，加玻璃珠5 粒/瓶），121 ℃滅菌20 min 后待培養基冷卻至常溫，每個三角瓶接入5 片直徑為8 mm 的杏鮑菇528 菌塊，置于25 ℃、180 rpm 恒溫振蕩培養箱中遮光培養7 d 停止試驗，取出氣生菌絲和玻璃珠，按1.2.1方法檢測其發酵物干重。最終根據發酵物干重、沉淀物情況和初始pH 值，來篩選適宜杏鮑菇528 深層發酵培養的初始配方。

1.3.3 不同氨基酸對杏鮑菇528 液體培養發酵物麥角硫因含量的影響 在1.3.2 確定的深層發酵培養初始配方中分別添加0.15%濃度的待篩選氨基酸：天冬氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酸，每個處理3 次重復。將培養液分裝于250 mL 三角瓶中（100 mL/瓶，加玻璃珠5 粒/瓶），121 ℃滅菌20 min后待培養基冷卻至常溫，每瓶接入10 mL 的杏鮑菇528 液體母種，置于25 ℃、180 rpm 恒溫振蕩培養箱中遮光培養7 d 停止試驗，取出氣生菌絲和玻璃珠，將發酵物按1.2.1 方法真空冷凍干燥，凍干后按1.2.2方法檢測每個處理重復的混合樣本中的麥角硫因含量，根據發酵物干重和檢測出的麥角硫因含量來篩選有助于提高杏鮑菇發酵物麥角硫因含量的氨基酸。

1.3.4 提高杏鮑菇528 發酵物麥角硫因含量發酵配方的正交試驗設計 根據固體培養的碳氮源及液體培養的氨基酸篩選試驗結果，提高杏鮑菇528 發酵物麥角硫因含量的發酵配方設計采用三因素三水平的正交試驗，以麥角硫因含量作為考察指標，按照L9（34）正交表安排試驗，因素水平如表1 所示。250 mL 三角瓶裝液量為100 mL，加玻璃珠5 粒/瓶，121 ℃滅菌20 min 后待培養基冷卻至常溫。每瓶接入杏鮑菇528 液體母種10 mL，置于25 ℃、180 rpm恒溫振蕩培養箱中遮光培養7 d 停止試驗，取出氣生菌絲和玻璃珠，按1.2.1 方法將發酵物真空冷凍干燥，凍干后將每個處理重復樣本混勻并按1.2.2 方法檢測其麥角硫因含量。采用正交設計助手LATIN 3.1 對L9（34）正交試驗結果進行分析，以確定提高杏鮑菇發酵物麥角硫因含量的發酵配方。

表1 正交試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

2 結果與分析

2.1 不同碳氮源培養基對杏鮑菇528 菌絲生長的影響

從圖1 菌絲生長態勢和圖2-A 菌絲生長速率變化可以看出，杏鮑菇528 菌絲在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和玉米糝粉這5 種碳源制作的PDA 平板培養基都可以生長，但菌絲生長情況存在差異，這表明杏鮑菇528 菌種對碳源的利用有選擇性。試驗結果表明，在25 ℃培養箱內遮光培養且其他培養條件不變時，玉米糝粉培養基中杏鮑菇菌絲生長態勢最強，生長速率最快，菌絲整齊均勻、潔白濃密，到第9 d 菌絲基本達滿皿水平；蔗糖培養基次之，菌絲長滿平皿的80%（7.2 cm）；麥芽糖和葡萄糖培養基的菌絲也較潔白濃密，菌絲達滿皿的70%～80%；乳糖培養基的菌絲雖濃白，但生長態勢最弱，生長速度最慢，到第9 d 菌絲才達其他處理組一半的水平。因此，其他培養條件不變時，適宜杏鮑菇528 菌絲生長的碳源為玉米糝粉。

圖1 不同碳、氮源培養基對杏鮑菇528 菌絲生長的影響（第9 d，左為碳源，右為氮源）Fig.1 Effects of different carbon and nitrogen source culture media on mycelial growth of Pleurotus eryngii 528 (At 9th day,left as carbon sources,right as nitrogen sources)

圖2 不同碳、氮源培養基杏鮑菇528 菌絲生長速率變化（A 為碳源，B 為氮源）Fig.2 Variation of mycelial growth rate of Pleurotus eryngii 528 with different carbon and nitrogen sources (A is carbon sources,B is nitrogen sources)

由圖1 和圖2-B 可知，杏鮑菇528 菌絲在添加不同添加氮源的PDA 平板培養基上也均能生長，但長勢存在差異，按菌絲總體生長態勢由好到差排序為：蛋白胨＞牛肉膏 ≈ 酵母粉＞玉米漿。蛋白胨培養基上的杏鮑菇菌絲生長最快，且旺盛、整齊均勻，到第9 d 菌絲接近滿皿水平；牛肉膏和酵母粉培養基次之，菌絲達滿皿的70%～80%；而玉米漿培養基的菌絲也可生長，且濃白，但生長最慢，長勢才達其他處理組一半左右的水平，明顯不如其他氮源的培養基。試驗結果表明，蛋白胨為杏鮑菇528 菌絲生長的適宜氮源。此研究結果與晏愛芬等[16]和馬璐[17]研究的杏鮑菇菌絲適宜碳氮源結果存在差異，這可能是杏鮑菇菌株不同導致其營養條件需求不一樣。

2.2 玉米糝粉和蛋白胨的比例對杏鮑菇528 深層發酵培養的影響

在其他培養基成分不變的條件下，不同比例玉米糝粉和蛋白胨對杏鮑菇528 深層發酵培養發酵物干重的影響結果見表2。試驗發現，玉米糝粉比例的加大，會使培養基沉淀物增多，這可能是由于玉米糝粉在蒸煮過程中淀粉糊化，釋放于培養液中，導致培養液中存在或多或少的沉淀物，這些淀粉沉淀的溶出增加了培養液的碳源濃度。當玉米糝粉比例為2%時，發酵物干重顯著高于1%比例（P＜0.05），但與3%比例沒有明顯變化。從表2 可知，蛋白胨可在一定范圍內調節培養液的初始pH 值，當蛋白胨添加量≤1.0%濃度時，培養液初始pH 值＜5.00，這不利于杏鮑菇528深層發酵培養，其發酵物干重顯著低于其他添加量處理組。不同玉米糝粉和蛋白胨濃度對杏鮑菇528液體深層發酵的菌絲生長有顯著影響，在其它培養條件不變下，2.0%玉米糝粉和2.0%蛋白胨培養液制備的杏鮑菇發酵物干重最多，達33.30±0.81 g·L-1，顯著高于其他碳氮源配比組合。因此，杏鮑菇528 深層發酵培養適宜配方確定為：玉米糝粉2.0%、蛋白胨2.0%、麥麩細粉1.0%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、谷氨酸0.1%和維生素B60.1%。

表2 不同比例玉米糝粉和蛋白胨對杏鮑菇528 深層發酵培養液的沉淀物情況、初始pH 及發酵物干重影響Table 2 Effects of different proportions of corn grits and peptone on the sediment condition,initial pH in culture medium and dry weight of fermentation products of Pleurotus eryngii 528 submerged fermentation

2.3 氨基酸對杏鮑菇528 液體培養發酵物麥角硫因的影響

在2.2 確定的杏鮑菇528 深層發酵基礎培養基上添加天冬氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酸，考察這5 種氨基酸對杏鮑菇528 液體培養菌絲體合成麥角硫因的影響，結果見圖3。

圖3 不同氨基酸對發酵物麥角硫因含量的影響Fig.3 Effects of different amino acids on the content of ergothioneine in fermentation product

試驗發現，外源氨基酸對杏鮑菇528 液體培養發酵物干重沒有顯著影響，但圖3 可知，天冬氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酸這5 種氨基酸均可不同程度提高杏鮑菇528 液體培養發酵物麥角硫因含量。其中，組氨酸的效果最明顯，其發酵物麥角硫因含量為10.86 mg·L-1，分別是對照組（CK）的3.73 倍、天冬氨酸組的2.96 倍、精氨酸組的2.47 倍、半胱胺酸組的2.18 倍和谷氨酸組的1.66倍。試驗結果表明，組氨酸的添加有效促進了杏鮑菇528 菌絲體發酵過程中麥角硫因的合成積累，杏鮑菇528 菌絲體麥角硫因含量比對照組增加了2.73倍，推測組氨酸可能是杏鮑菇528 生物合成麥角硫因的前體，因此，選擇組氨酸為提高杏鮑菇528 液體培養發酵物麥角硫因含量的外源氨基酸。不同真菌生物合成麥角硫因的前體不一樣。MELVILLE D B[18]等采用同位素示蹤法證明了粗糙鏈孢霉合成麥角硫因的前體為組氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸；梅保良[19]研究表明蛋氨酸和半胱氨酸可提高糙皮側耳CGMCC 6232 深層發酵菌絲體麥角硫因含量。本研究發現組氨酸可促進杏鮑菇528 菌絲體生物合成麥角硫因，但具體生物合成途徑有待進一步研究。

2.4 以麥角硫因為目標產物的正交試驗

2.4.1 正交試驗結果分析 正交試驗對杏鮑菇528 發酵物麥角硫因含量的數據分析結果見表3 和表4。由表3 極差分析可知，各因素的影響的主次順序為：C＞A＞B，即組氨酸＞玉米糝粉＞蛋白胨。方差分析結果顯示，只有組氨酸呈顯著水平（P＜0.05），其余各因素對發酵物麥角硫因含量的影響均不顯著。在9 個序列組合中，序列4 組合的麥角硫因含量最高，達19.48 mg·L-1。因此，確定提高杏鮑菇528 發酵物麥角硫因產率的最佳發酵培養基配方為：玉米糝粉2.0%、蛋白胨1.5%、組氨酸0.15%、麥麩細粉1.0%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、谷氨酸0.1% 和維生素B60.1%。

表3 L9（34）正交試驗結果Table 3 The results of L9(34)orthogonal test

表4 正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4.2 正交試驗驗證 對正交試驗結果篩選的配方進行驗證試驗，重復6 次，檢測出的麥角硫因平均含量為20.50±1.80 mg·L-1，驗證試驗結果與正交試驗方案結果相符合，說明該配方能有效提高杏鮑菇發酵物中麥角硫因的含量。

3 討論與結論

適宜杏鮑菇528 菌絲生長的碳氮源分別為玉米糝粉和蛋白胨；組氨酸可有效促進杏鮑菇528 菌絲體深層發酵過程中麥角硫因的合成積累，添加組氨酸組的菌絲體麥角硫因含量比對照組增加了2.73 倍，推測組氨酸可能是杏鮑菇528 生物合成麥角硫因的前體；杏鮑菇528 深層發酵生物合成麥角硫因的最佳培養基配方為：玉米糝粉2.0%、蛋白胨1.5%、組氨酸0.15%、麥麩細粉1.0%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、谷氨酸0.1%和維生素B60.1%，在此條件下，杏鮑菇發酵物麥角硫因含量達20.50±1.80 mg·L-1。

本文試驗表明，通過碳氮源、氨基酸等營養控制手段來調控杏鮑菇528 深層發酵物中的EGT 含量是可行且有效的，該方法操作簡單，生產成本低，適宜規?；a，可為開發富含EGT 的功能食品研發提供安全原料，應用前景大。

杏鮑菇528 深層發酵不僅與培養液營養因子密切相關，還與培養溫度、通氣量、攪拌速度等發酵條件密切相關[20-22]。本研究僅基于營養調控手段來研究提高杏鮑菇528 發酵物EGT 含量的方法，后續仍需優化提高發酵物EGT 含量的杏鮑菇528 深層發酵的培養條件，進一步探究EGT 生物合成途徑和機理。