湖北道地藥材貝母ISSR反應體系優化及多態性引物篩選

蔣小剛，王 華，郭坤元，張美德

（湖北省農業科學院中藥材研究所/國家中藥材產業技術體系恩施綜合試驗站/湖北省農業科技創新中心中藥材分中心，湖北 恩施 445000）

0 引言

【研究意義】湖北貝母（Fritillaria hupehensisHsiao et K.C.Hsia）屬于百合科貝母屬多年生草本植物，主要分布于湖北西南部，在恩施、建始、五峰等地有大面積種植，距今已有200 多年的栽培歷史，是湖北省道地藥材之一[1-2]。湖北貝母鱗莖中含有活性成分生物堿，牛換云等[3]通過體外抑菌試驗發現湖北貝母總生物堿及單體生物堿對革蘭氏陽性菌的抑菌作用強于革蘭氏陰性菌，表明湖北貝母總生物堿以及單體生物堿均有一定的抑菌活性；張勇慧等[4]以小鼠為研究對象，發現湖北貝母生物堿單體比如鄂貝甲素、湖貝甲素苷具有鎮咳祛痰的功效。隨著研究的不斷深入，湖北貝母的藥用價值逐漸得到了人們的認可，《中華人民共和國藥典》最新幾版均收載了湖北貝母，使其成為國家法定中藥材[5]。湖北貝母以干燥鱗莖入藥，具有清肺化痰、止咳、散結的功能，主要用于治療熱痰咳嗽，痰核瘰疬，癰腫瘡毒等癥狀[6-7]。近年來，中藥材產業正處于蓬勃發展階段，巨大利益驅動下湖北貝母等藥材市場出現品種混雜、質量參差不齊的現象。因此，構建高效快捷的鑒別體系對于湖北貝母的鑒定及資源保護具有重要意義。【前人研究進展】ISSR 分子標記是一種基于微衛星序列開發的新型分子標記技術，該方法操作簡單，尤其適用于檢測基因組序列未知的物種的多樣性[8-9]。余志雄等[10]采用單因素試驗結合正交設計的方法，建立了火龍果ISSR-PCR優化體系，并發現相比于DNA 模板含量，dNTP、引物和TaqDNA 聚合酶含量對ISSR-PCR 反應影響更大；采用上述建立的優化體系，袁亞芳等[11]對福建地區20 份火龍果種質進行遺傳多樣性分析，初步揭示了不同地區種質親緣關系，為火龍果種質鑒定和品種選育提供價值；張立杰等[12]采用正交設計的方法優化蓮霧ISSR-PCR 反應體系，發現引物濃度是影響PCR 的最重要因素，建立的優化體系將為蓮霧種質資源評價、優良品種選育等提供科學依據。何橋等[13]用建立的優化體系將14 份蓮霧種質聚類為4 組，與按照果實成熟期的劃分結果基本一致。此外，在白術[14]、淫羊藿[15]、獼猴桃[16]等藥用植物也開展了ISSR-PCR 優化體系的研究，這些研究將為藥用植物的種質資源鑒定、親緣關系、遺傳多樣性分析、良種選育等提供科學依據。【本研究切入點】目前在湖北貝母的研究多集中于生態種植、病蟲害防治、藥理藥效等方面[7,17]，湖北貝母遺傳多樣性分析的研究有待深入探討，因此亟需進行湖北貝母的遺傳多樣性分析。【擬解決的關鍵問題】本研究擬采用均勻設計和單因素試驗結合的方法，進行湖北貝母ISSR-PCR 體系優化、多態性引物篩選及遺傳多樣性分析，為湖北貝母種質鑒定及品種選育奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料采集于恩施市新塘鄉湖北貝母資源圃，包括湖北恩施市、利川市、建始縣等產地的12 份湖北貝母葉片樣品，產地信息見表1，隨機選取每個產地3 株植株的幼嫩葉片作為一份樣品，裝入自封袋中，回實驗室后，保存于-20 ℃冰箱備用。

表1 12 份湖北貝母種質資源產地Table 1 Producing areas of 12 F.hupehensis germplasms

1.2 試劑與儀器

供試的ISSR 引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）設計的100 條引物序列，由上海英俊生物技術公司合成，核酸染料Gel-red 以及2×TaqMaster Mix均購自武漢中恩科技有限公司。主要儀器設備：離心機（SIGMA 3K15）、電泳儀（DYCP-31DN）、超微量核酸測定儀（Thermo NANODROP ONE）、PCR 儀（DYY-12）。

1.3 基因組DNA 提取與檢測

采用北京天根生物科技有限公司的新型植物DNA提取試劑盒，提取12 份湖北貝母葉片基因組DNA，通過分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳對DNA 的濃度和質量進行檢測，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.4 ISSR-PCR 體系均勻設計

均勻設計原理是基于數論中的一致分布理論，將數論和多元統計相結合，充分考慮試驗點在試驗范圍內的“均衡分散”性，使試驗點均勻分布[18]。本研究采用3 因素4 水平的U12（43）均勻設計表設計PCR體系各因素水平（表2、表3），以引物UBC873 為例，DNA 模板濃度為50 ng·μL-1，引物濃度為2.5 μmol·L-1，通過12 個20 μL 反應體系，篩序較優ISSR-PCR 體系。PCR 程序：（1）94 ℃，預變性5 min；（2）94 ℃，變性0.75 min，52 ℃，復性0.75 min，延伸1.5 min，共40 個循環；（3）最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

表3 ISSR-PCR 均勻設計U12（43）Table 3 Mixed uniform design U12（43）for ISSR-PCR （單位:μL）

1.5 ISSR-PCR 體系單因素試驗

基于U12（43）均勻設計試驗確定的較優ISSRPCR 體系，進行2×TaqMaster mix（表4）、模板DNA（表5）、引物（表6）的單因素試驗，反應體系20 uL，PCR 程序同 ISSR-PCR 體系均勻設計。

表4 2×Taq Master mix 的單因素試驗設計Table 4 Single factor screening test on 2×Taq Master Mix （單位:μL）

表5 模板DNA 的單因素試驗設計Table 5 Single factor screening test on DNA （單位:μL）

1.6 最佳退火溫度確定

基于優化的ISSR-PCR 體系篩選ISSR 引物的最佳退火溫度，基于引物TM 值設置8 個退火溫度，PCR 程序其他條件同上。

1.7 最優反應體系驗證

基于優化的ISSR-PCR 體系，用引物UBC866 對12 份不同產地的湖北貝母資源進行優化體系驗證，優化體系（20 μL）：DNA 模板0.8 uL（40.0 ng），2×TaqMaster mix 10.5 μL，引 物2.2 μL（5.5 μmol），ddH2O 6.5 μL。PCR 程序：（1）94 ℃，預變性5 min；（2）94 ℃，變性0.75 min，60.0 ℃，退火0.75 min，延伸1.5 min，共40 個循環；（3）最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA 提取及檢測

由圖1 可知，提取的12 份湖北貝母基因組DNA條帶清晰，無拖尾，中藥材條形碼ITS2引物都擴增出500 bp 左右的片段，條帶清晰明亮（圖2），表明提取的湖北貝母基因組DNA 質量高，可用于后續ISSR-PCR 體系建立與優化。

圖1 12 份湖北貝母基因組DNA 電泳圖Fig.1 DNA electrophoretograms of 12 F.hupehensis germplasms

圖2 12 份湖北貝母ITS2 擴增結果Fig.2 ITS2 amplifications on 12 F.hupehensis germplasms

2.2 均勻設計優化ISSR-PCR體系

以湖北貝母基因組DNA 為模板，UBC873 為擴增引物，采用均勻設計U12（43）方法建立ISSRPCR 體系，每個處理設置3 個重復（表3）。圖3 結果表明，除處理4、5、12 外，其他處理各重復都擴增出5 個條帶，而處理6 擴增條帶最亮，重復性好，且2×TaqMaster mix 用量較少，綜合考量條帶數量、亮度、2×TaqMaster mix 用量、重復性等因素，選擇處理6 作為ISSR-PCR 初步較優體系。

圖3 ISSR-PCR 均勻設計U12（43）擴增結果Fig.3 Results of U12(43) uniform design experiment for ISSR-PCR

2.3 單因素試驗優化ISSR-PCR 體系

2.3.1 2×TaqMaster mix 的單因素試驗 在均勻設計處理6 的基礎上進行2×TaqMaster mix 的單因素試驗（表4），每個處理3 個重復。由圖4 可知，各處理的3 個重復都能擴增出5 條帶，而處理4 的3 個重復整體的條帶亮度和清晰度都最高，因此10.5 uL 為2×TaqMaster mix 的單因素試驗的最佳用量。

圖4 2×Taq Master mix 單因素試驗設計的ISSR-PCRFig.4 ISSR-PCR of single factor screening test on 2×Taq Master Mix

2.3.2 模板DNA 的單因素試驗 在2×TaqMaster mix的單因素試驗的處理4 基礎上，進行模板DNA 的單因素試驗（表5），由圖5 可知，各處理都能擴增出5 條清晰條帶，處理3、4、5、6 條帶亮度基本一致，考慮DNA 用量的經濟適用性，處理3 為最優處理，即0.8 μL（40.0 ng）為模板DNA 的單因素試驗的最佳用量。

圖5 模板DNA 的單因素試驗設計的ISSR-PCRFig.5 ISSR-PCR of single factor screening test on DNA

2.3.3 引物的單因素試驗 在模板DNA 的單因素試驗處理3 的基礎上，進行引物的單因素試驗設計（表6），由圖6 可知，處理5 整體條帶亮度和清晰度都高于其他各處理，表明2.2 μL 為引物單因素試驗最佳用量。

圖6 引物的單因素試驗設計的ISSR-PCRFig.6 ISSR-PCR of single factor screening test on DNA

表6 引物的單因素試驗設計Table 6 Single factor screening test on primers （單位：μL）

2.4 最佳退火溫度的確定

基于優化的ISSR-PCR 體系通過梯度退火溫度試驗確定引物的最佳退火溫度，以引物UBC848 為例（圖7），退火溫度為59.3 ℃時，引物UBC848 擴增的條帶數最多，且條帶最明亮清晰，退火溫度過高或過低時，條帶數和清晰度明顯降低，表明引物UBC848 的最佳退火溫度為59.3 ℃，其余引物的最佳退火溫度見表7。

圖7 引物UBC848 不同退火溫度擴增Fig.7 Amplification of primer UBC848 at different annealing temperatures

2.5 優化體系驗證

優化的ISSR-PCR 體系（20 μL）：2×TaqMaster mix 10.5 μL，模板DNA 0.8 μL（40.0 ng），引物2.2 uL（5.5 μmol），ddH2O 6.5 μL。用表7 篩選的多態性引物對表1 的12 份湖北貝母資源進行優化體系驗證。圖8 為引物 UBC866 的擴增結果，可見擴增條帶清晰，多態性豐富，表明優化的ISSR-PCR 體系穩定可靠，可用于湖北貝母ISSR 分析。

圖8 引物 UBC866 對12 份湖北貝母資源的擴增結果Fig.8 Amplification results of 12 F.hupehensis germplasms by primer UBC866

表7 ISSR 引物最佳退火溫度Table 7 Optimum primer annealing temperature

2.6 遺傳多樣性分析結果

采用NTSYS-pc2.1 分析12 份湖北貝母種質遺傳相似系數。如表8 所示，各種質間遺傳相似系數范圍為0.542 9～0.942 9，其中FH3 和FH5，FH1 和FH12的遺傳相似系數最大，都為0.942 9，表明FH3 和FH5，FH1 和FH12 的親緣關系最近；其中FH8 和FH11 的遺傳相似系數最小，為0.542 9，表明FH8 和FH11 的親緣關系最遠。采用UPGMA 聚類法對供試材料進行聚類分析，由圖9 知，遺傳相似系數為0.75 時，可將12 份湖北貝母種質聚為3 類，第一類包括FH1、FH2、FH3、FH5、FH6、FH7、FH11、FH12，第二類包括FH4、FH8、FH9，第三類包括FH10。

圖9 12 份湖北貝母種質聚類分析Fig.9 Cluster diagram of 12 F.hupehensis germplasms

表8 12 份湖北貝母遺傳相似系數Table 8 Genetic similarity coefficients of 12 F.hupehensis germplasms

3 討論與結論

ISSR 分子標記技術已被廣泛應用于植物、微生物的種質資源鑒定、遺傳多樣性分析等研究中，相比傳統分子標記，ISSR 分子標記具有數量多、易檢測、成本低的優勢[16]。ISSR-PCR 反應易受酶、DNA模板、引物等因素的綜合影響，因此需要對反應體系進行優化。目前，很多研究采用正交設計和單因素試驗的方法優化ISSR-PCR 體系[19]，而本研究采用的是均勻設計結合單因素試驗，在原理上，均勻設計與正交設計相似，能均衡考慮各因素的影響，簡化試驗程序和步驟[14,18]，但相比于多數研究采用的L16（45）正交試驗設計[19-20]，本研究采用的U12（43）均勻設計在保證實驗結果的基礎上，能減少工作量和節省時間。

DNA 模板、Taq酶、Mg2+、dNTP 等是PCR 擴增反應的重要因素，本研究中，用2×TaqMaster mix代替了Taq酶、Mg2+、dNTP、緩沖液。單因素試驗結果表明，DNA 模板及引物用量對反應結果影響最大，DNA 模板和引物含量過低會降低反應效率，過高導致非特異性擴增，這與丁雯等[20]研究結果一致。2×TaqMaster mix用量也是較為重要的影響因素，隨著2×TaqMaster mix 用量增加，條帶亮度緩慢升高，繼續增加至一定量時，條帶亮度降低，這與郭傲等[21]研究結果較為一致，表明2×TaqMaster mix 濃度過低時，合成產物較少，濃度過高時，會導致非特異性擴增，條帶清晰度降低。

研究表明引物的退火溫度高低對擴增結果影響較大。退火溫度過高，引物與模板不易結合，導致擴增效率降低；退火溫度過低，引物與模板易錯配結合，出現非特異性擴增，表現拖尾現象[22]。本研究基于優化的ISSR-PCR 體系通過梯度退火試驗篩選引物的最佳退火溫度，結果表明，篩選的大部分引物最佳退火溫度值整體較高，在一定范圍內隨著退火溫度的升高，條帶數和清晰度逐漸增加，而當退火溫度升高至一定值后，條帶數和清晰度減小，這與閆林等[23]研究結果較為一致，表明篩選的引物基本都能適應較高的退火溫度。基于優化的ISSRPCR 體系，通過梯度退火溫度試驗篩選引物的最佳退火溫度，用篩選后的引物U866 對12 份湖北貝母資源進行ISSR-PCR 優化體系驗證，結果表明，優化體系擴增的條帶清晰穩定，多態性較好，適用于遺傳多樣性分析。

聚類分析可將供試種質聚為3 類，表明篩選的多態性ISSR 引物適用于區分不同種質遺傳差異，供試種質親緣關系無地域性差異，這與浙貝母、新疆貝母的遺傳多樣性研究結果存在差異[24-25]，此類差異形成原因可能與不同貝母屬種質遺傳穩定性、采樣地點、采樣數量等有關。本研究結果將為湖北貝母種質鑒定及良種選育提供參考依據。