新型鵝星狀病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應用

余明興，林裕勝

（1.福建省浦城縣動物疫病預防控制中心，福建 浦城 353400；2.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】2017 年以來，我國江蘇、河南、河北、廣東、福建、安徽、浙江等多省養鵝場暴發了由新型鵝星狀病毒引起的雛鵝痛風病。該病主要發生于5～20 日齡雛鵝，臨床癥狀主要表現為站立不穩、消瘦、精神沉郁、采食量下降，剖檢可見腎臟、肝臟及關節處有尿酸鹽沉積，其發病率在30%左右，死亡率最高可達50%[1-3]，給我國養鵝業造成了巨大的經濟損失。福建省是鵝星狀病毒病的首發疫區之一。鑒于目前市面上尚無可預防或治療該病的相關疫苗或藥物，使得該病的防控異常困難。因此，建立一種快速檢測新型鵝星狀病毒的檢測方法對于該病早期診斷顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】鵝星狀病毒屬于星狀病毒科（Astroviridae）禽星狀病毒屬（Avastrovirus），經基因組解析后發現與火雞星狀病毒和鴨星狀病毒有明顯不同，屬于新的基因型，因此當前命名為新型鵝星狀病毒[4-5]。目前新型鵝星狀病毒的診斷方法主要有分離鑒定法、電鏡觀察法、常規PCR 法、LAMP 法和熒光定量PCR 法[6]。分離鑒定法主要通過接種鵝胚或鵝胚腎細胞，一般需要傳至3 代左右才可出現鵝胚死亡或出現明顯病變，比較耗費時間。電鏡觀察法是星狀病毒早期的檢測方法之一，然而Yuan等[7]使用鵝肝臟超薄切片進行觀察，卻無法觀察到星狀病毒特有的形態，因此該方法存在一定的缺陷。在分子診斷技術方面，前人也進行了相關研究，如張玉霞等[8]基于ORF1b基因建立的LAMP 檢測方法，邱思語等[9]基于ORF1b建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR方法，白彩霞等[10]基于ORF2 建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR方法，Yuan 等[11]基于ORF1b建立的TaqMan 實時熒光定量RT-PCR 方法。分子生物學方法是目前病原檢測應用最廣泛的一種方法，尤其是PCR 技術，因能檢測到微量的病原DNA 而常應用于病原體的早期檢測，與分離培養法、電鏡分離法、ELISA 法和免疫熒光檢測法等相比具有一定優勢[12]。姜勝男等[13]、蒲路莎等[14]研究表明當前流行的新型鵝星狀病毒毒株之間ORF2 核苷酸編碼的氨基酸同源性高達99.4%以上，保守性較高，適合作為病原診斷靶基因?！颈狙芯壳腥朦c】為進一步擴展新型鵝星狀病毒的檢測方法，本研究根據新型鵝星狀病毒ORF2基因為靶基因建立新型鵝星狀病毒 RTPCR 檢測方法?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用Oligo 7 軟件設計并篩選出1 對特異性引物，建立適用于檢測新型鵝星狀病毒的RT-PCR 方法，為新型鵝星狀病毒病臨床樣品的快速檢測和流行病學調查提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株及臨床樣品 新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）、禽呼腸孤病毒（Avian reovirus,ARV）、鵝細小病毒（Goose parvovirus,GPV）、鵝多瘤病毒（Goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV）、鵝圓環病毒（Goose vircovirus,GoCV）和新型鵝星狀病毒等DNA 或cDNA 由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所動物病毒研究室提供。45 份臨床樣品于2019–2020 年期間采自福建省浦城縣，均為臨床上疑似鵝痛風的脾、腎組織和關節液，發病鵝表現為關節腫大，剖檢腎臟表面可見大量尿酸鹽沉積。

1.1.2 主要試劑 病毒RNA/DNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司；Ex TaqDNA 聚合酶、DL2000、DL1000 Marker 均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計合成 根據GenBank 登錄的新型鵝星狀病毒SDXT 株（No.MN399857）ORF2 基因序列，利用Oligo 7 軟件設計并篩選出1 對特異性引物，引物的核苷酸序列為：P1:5′-ATGAAGGCCGAGAG GAAGCTT -3′；P2：5′-GTTCAAGATGCGGCCGA GC -3′。擴增片段大小為384 bp。引物由福州博尚生物有限公司合成。

1.2.2 核酸抽提 利用病毒DNA/RNA 提取試劑盒、參照說明書分別提取供試病毒和臨床樣品的DNA 和RNA，用作PCR 反應的模板。

1.2.3 反應條件及優化 cDNA 合成按照全式金生物技術有限公司反轉錄試劑盒操作手冊進行。反應程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 終止反應。PCR 擴增采用 25 μL 體系，Premix 12.5 μL，反轉錄產物 cDNA 2 μL，上下游引物濃度采用矩陣法在0.4～1.2 μmol·L-1調整，無菌去酶水補足20 μL。PCR 反應程序：擴增條件為 95 ℃ 5 min 熱啟動，94 ℃變性15 s，退火溫度在50 ℃～60 ℃調整 15 s，72 ℃延伸15 s，35 個循環，72 ℃ 延伸 7 min。待反應結束后取 PCR 產物 7 μL，1.5%瓊脂凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統掃描儀下觀察拍照。擴增的特異性片段割膠回收后純化，再送測序公司測序，通過Blast比對驗證擴增片段的正確性。

1.2.4 特異性試驗 應用建立的 RT--PCR 方法擴增新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環病毒，檢驗建立方法的特異性效果。

1.2.5 敏感性試驗 將反轉錄得到的新型鵝星狀病毒cDNA（原液濃度為62 ng·μL-1）進行10 倍遞增稀釋，共稀釋成9 個濃度梯度，分別為6.2 ng·μL-1、620 pg·μL-1、62 pg·μL-1、6.2 pg·μL-1、620 fg·μL-1、62 fg·μL-1、6.2 fg·μL-1、620 ag·μL-1、62 ag·μL-1，利用優化好的方法進行擴增，檢驗該方法的敏感性。

1.2.6 重復性試驗 利用建立的新型鵝星狀病毒RTPCR 方法對3 份新型鵝星狀病毒分離株cDNA 進行 3次 RT--PCR 擴增。進行批內重復試驗時，每次樣品均設3 個重復；進行批間重復試驗時，3 份新型鵝星狀病毒cDNA 樣品間隔5 d 檢測1 次，共檢測3 次。

1.2.7 RT-PCR 方法初步應用 利用建立的RT-PCR方法對從浦城采集的45 份臨床樣品進行檢測，同時設置新城疫病毒和鵝細小病毒做陰性對照。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR 反應條件的優化及擴增產物的鑒定

RT-PCR 最佳反應體系為：Premix 10 μL，ORF2上下游引物濃度10 μmol·L-1各1 μL，模板3 μL，無菌去離子水補足至20 μL。最佳反應程序為：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，30 個 循環；72 ℃ 10 min。應用優化后的體系對新型鵝星狀病毒進行擴增，并對擴增產物進行測序，結果顯示，新型鵝星狀病毒經瓊脂糖凝膠電泳擴增出1 條約380 bp 的目的片段，與預期大小一致（圖1）。測序結果顯示，RT-PCR 擴增的新型鵝星狀病毒ORFV基因序列長度為384 bp，與參考的MN399857 株序列同源性為99.8%，與預期結果相符。

圖1 新型鵝星狀病毒ORF2 基因的RT-PCR 擴增結果Fig.1 Amplification on ORF2 of NGAstV by RT-PCR

2.2 特異性擴增

利用建立的RT-PCR 檢測方法對新型鵝星狀病毒、新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環病毒的核酸進行檢測，同時設置空白對照。結果顯示，僅新型鵝星狀病毒擴增出與預期大小相符的目的條帶，而新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環病毒和去離子水樣品均為陰性（圖2），表明建立的RTPCR 方法具有良好的特異性。

圖2 新型鵝星狀病毒RT-PCR 特異性試驗結果Fig.2 Specificity of NGAstV detection by RT-PCR

2.3 敏感性試驗

新型鵝星狀病毒核酸反轉錄后的cDNA 濃度為62 ng·μL-1，以10倍系列稀釋成6.2 ng·μL-1、620 pg·μL-1、62 pg·μL-1、6.2 pg·μL-1、620 fg·μL-1、62 fg·μL-1、6.2 fg·μL-1、620 ag·μL-1、62 ag·μL-1進行PCR敏感性試驗，結果顯示：建立的新型鵝星狀病毒RTPCR 方法的檢測限均為62 fg·μL-1（圖3）。

圖3 RT-PCR 敏感性試驗Fig.3 Sensitivity of RT-PCR assay

2.4 重復性試驗

利用建立的新型鵝星狀病毒RT-PCR 方法對3 份新型鵝星狀病毒陽性樣品，新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環病毒各1 份作陰性對照進行批內重復和批間重復試驗。結果顯示，批內和批間試驗結果均一致（圖略），即除了3 份新型鵝星狀病毒陽性樣品有擴增條帶，其余樣品均無擴增條帶，表明重復性好。

2.5 臨床樣品檢測結果

利用建立的RT-PCR 方法對45 份臨床樣品進行檢測。結果顯示，45 份樣品中新型鵝星狀病毒共檢測出15 份，陽性率為33.33%（15/45），表明該病在浦城縣流行較為嚴重，應引起重視，圖4 為部分臨床樣品檢測結果。

圖4 部分臨床樣品RT-PCR 檢測結果Fig.4 Detection of NGAstV on clinical samples by RT-PCR assay

3 討論與結論

星狀病毒在我國水禽群體中分布地域廣泛且宿主范圍寬廣，能夠引起雞的腎炎、鴨的病毒性肝炎、火雞腸炎等。鵝的星狀病毒病是近年來通過多位學者[15-16]研究才確認的，然而目前對該病的致病機理尚不明確，缺乏有效的商品化疫苗，導致該病給養鵝業造成嚴重經濟損失。福建省南平市是養鵝大市，因該病給養鵝戶造成的經濟損失較為嚴重。為了更好地對福建省新型鵝星狀病毒病有更好的了解，為養殖戶提供更為快速便捷的檢測結果，建立一種用于檢測新型鵝星狀病毒的RT-PCR 方法顯得尤為重要。

隨著規?；B殖場的不斷發展，當前多種疫病臨床癥狀十分接近，剖解病變相差無幾，不利于精準確定病因，耽誤最佳治療時間。分子生物學檢測技術已然成為輔助臨床診斷的主要方法。PCR 技術是目前所有動物疫病中應用最為廣泛的技術之一，與熒光定量PCR 技術相比，不需要昂貴的儀器設備，而且操作流程簡單，適合于基層工作者使用。

目前建立鵝星狀病毒的分子診斷技術有張玉霞等[8]基于ORF1b基因建立的LAMP 檢測方法，其靈敏度為1 ng·μL-1；邱思語等[9]基于ORF1b建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法，其靈敏度為24.2 拷貝·μL-1，白彩霞等[10]基于ORF2 基于建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法，其靈敏度為3.75 拷貝·μL-1，Yuan 等[11]基于ORF1b建立的TaqMan 實時熒光定量RT-PCR 方法，其靈敏度為52.5 拷貝·μL-1。本研究根據新型鵝星狀病毒ORF2 基因設計1 對特異性的引物，通過對引物濃度和退火溫度的優化，建立了新型鵝星狀病毒RT-PCR 檢測方法，其靈敏度為62 fg·μL-1，與邱思語等[9]、白彩霞等[10]、Yuan 等[11]建立熒光定量PCR 方法相比其靈敏性相距較遠，但與張玉霞等[8]建立的LAMP 方法相比，本研究建立的方法靈敏度高100 倍。此外，本研究建立的方法對鵝常見病毒均未有檢測出，表明特異性強；通過批內、批間重復驗證結果表明，該方法具有良好的穩定性。通過對45 份臨床樣品進行檢測，結果顯示15 份樣品陽性，陽性率為33.33%，提示新型鵝星狀病毒病應當引起當地有關部門重視。

本研究成功建立了新型鵝星狀病毒RT-PCR 檢測方法，其特異性強、穩定性好，可應用于臨床樣品的檢測，為及時控制該病提供有效的方法。