以黃漿水為基質的芽孢桿菌制劑制備工藝優化及功效分析

官雪芳，王 琦，鄭 琪，林 斌 ，黃菊青

[1.福建省農業科學院農業工程技術研究所，福建 福州 350002；2.福建省農產品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350002]

0 引言

【研究意義】枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類有著高效胞外蛋白分泌性能的益生菌[1-3]。該菌可調節腸道菌群平衡，增強動物機體免疫力[4]；分泌活性較高的內切葡聚糖酶，提高動物對高纖維飼料的吸收利用率，降低飼料成本[5]。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）能夠產生多種生物活性物質，包括多糖、蛋白質、非肽類物質和一些小分子活性物質[6-7]，具有抑制致病菌生長繁殖、改善腸道健康、促進動物生長、提高動物生產性能等特征[8-10]。在我國，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌已被批準為飼用微生物添加劑，是較為理想的工業生產菌株[5,11-12]。豆腐黃漿水作為豆腐生產加工中的副產物，主要由可溶性蛋白質、低聚糖、維生素、脂類、微量元素等組成，其產生量是大豆干重的3～5 倍[13]。前期研究發現，采用豆腐黃漿水為培養基時，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中的內切葡聚糖酶活力顯著高于基礎培養基[14]。采用黃漿水為基質進行芽孢桿菌制劑開發，可提高菌制劑中內切葡聚糖酶的含量，并充分利用了廢棄資源，節約了菌制劑原料生產成本；研發粉末型芽孢桿菌制劑的生產工藝，有利于保障菌制劑中的活菌數量，為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌更好地應用于畜禽無抗養殖、提高飼料吸收利用提供幫助。【前人研究進展】活性功效是評價微生態制劑的金標準，微生態制劑的活菌數、活性物質含量水平直接影響其作用效果[15]。現有報道的芽孢桿菌類益生菌的研究主要集中在對畜禽生長性能、腸道菌群調節、替代抗生素等的應用效果分析上[16-20]，在益生菌生產工藝的研究方面投入不足，目前僅見楊正楠等[21]以營養肉湯為培養基采用噴霧干燥法制備枯草芽孢桿菌制劑，并獲得最適保護劑為脫脂奶粉；關于豆腐黃漿水的利用研究，目前也主要集中在發酵生產紅曲色素[22]、紅棗復合飲料[13]、鮮味基料[23]、豆腐凝固劑[24]、細菌纖維素[25]、蝦青素[26]和B 族維生素[27]等方面。我國微生態制劑總體上存在菌制劑活菌數低、活性物質不穩定、生產和使用過程容易失活等諸多產品質量問題[13,15]，而液體菌制劑同時還存在包裝和運輸成本高、活菌衰減快等缺陷。【本研究切入點】目前，關于以豆腐黃漿水為培養基制備粉末型枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌類益生菌的報道仍比較少見。以黃漿水為發酵原料可降低菌制劑生產成本，粉末型芽孢桿菌制劑工藝技術的研發可克服液體菌制劑包裝和運輸成本高、活菌衰減快、菌制劑活菌數低、使用效果差等技術問題。【擬解決的關鍵問題】本研究以大豆加工廢水黃漿水為發酵原料，進行粉末芽孢桿菌益生菌的生產及制劑的研發，生產出枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發酵液，通過最佳芽孢形成率發酵工藝參數篩選，對保護劑、載體、加入量以及干燥工藝進行優化，獲得枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌活菌制劑的較優保藏配方及制備工藝，通過體外腸道模擬試驗、體外糖化試驗等評估菌制劑的使用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與培養基 枯草芽孢桿菌SB13 和地衣芽孢桿菌BL14 為福建省農業科學院農業工程技術研究所微生物能源與環保實驗室篩選的自有菌種，并保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號分別為CGMCC8867 和 CGMCC8865。黃漿水培養基：由福州美琪食品有限責任公司提供，公司采用傳統石膏豆腐制作工藝，具體為：將大豆與水按1∶8（m/v）的比例浸泡過夜，經研磨、豆腐過濾袋（100 目）過濾獲得豆漿，將豆漿煮沸，加入石膏至豆腐凝固，放置15 min，將豆腐腦倒入磨具中，擠壓獲得的流體即為黃漿水，將黃漿水121 ℃滅菌30 min 即為黃漿水培養基。基礎培養基：胰蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L，pH 調至7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.1.2 儀器 ZRS-8GD 智能溶出實驗儀（天津天大天發科技有限公司），SKHG-22A 熱泵干燥機（佛山阿思帕拉實業有限公司，FD-1-50 真空干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司），CLARIOstar 分光光度計（BMG LABTECH，SPX-80 恒溫培養箱（寧波江南儀器廠），ZCZY-70BS 恒溫搖床（上海知楚儀器有限公司），ADL311（S）噴霧干燥機（雅馬拓），SW-CJ-1F 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），MDF-U7386S 超低溫冰箱（日本松下）。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵液制備將菌株SB13 和BL14 于-80 ℃取出，以1%的量接種入基礎培養基中，37 ℃、160 r·min-1振搖培養24 h 獲得發酵母液。取黃漿水培養基，以1%的量接種SB13 和BL14，160 r·min-1，37 ℃恒溫培養24 h 獲得SB13 和BL14 發酵液，用于后續試驗。

1.2.2 最佳芽孢形成條件篩選 最佳芽孢形成時間：根據1% 的量分別接種SB13 和BL14 于黃漿水培養基中，160 r·min-1振搖，37 ℃恒溫培養，于培養12、24、36、48、72、96 h 時取樣檢測芽孢產生率。最佳產芽孢溫度：將菌株SB13 和BL14 母液接種于黃漿水培養基中，分別置于20、25、30、35、40 ℃，160 r·min-1培養，根據最佳產芽孢時間取樣檢測芽孢數。芽孢計數采用孔雀綠染色法，根據芽孢（綠色）和營養細胞（紅色）計算芽孢產生率，計算公式為：芽孢產生率/%=[ 芽孢數/（芽孢數+營養細胞數）]×100，確定最佳芽孢形成時間。每處理3 個重復。

1.2.3 保護劑及載體篩選 取SB13 和BL14 發酵液各100 mL，分別加入不同量保護劑（m/v）（10%甘油、10% 脫脂奶粉、10% 海藻糖、10% 麥芽糊精、10% 蔗糖、0.5% 海藻酸鈉），10% 量載體（m/v）（麥麩、米糠、稻殼、豆粕、淀粉），25 ℃下熱泵烘干，獲得待測樣品，以各發酵液處理前活菌數含量為對照（100%），測定存活率，篩選出最佳保護劑和載體。

1.2.4 最適保護劑及載體加入量篩選 以1.2.3 中獲得的最適保護劑和載體為優化對象，在100 mL 的SB13 和BL14 發酵菌液中分別加入2%～12%的保護劑及載體，25 ℃下熱泵烘干，獲得待測樣品，以發酵液處理前含菌量為對照，計算存活率并篩選出最佳保護劑和載體。

1.2.5 成品制備工藝 各取SB13 和BL14 發酵液100 mL，加入最佳保護劑和載體，分別采用常溫烘干（25 ℃、熱泵烘干72 h）；60 ℃烘干（60 ℃、熱泵烘干24 h）、噴霧干燥（進口溫度85 ℃、出口溫度60 ℃）、冷凍干燥（-80 ℃預冷凍、溫度-50 ℃、真空度23 Pa、干燥48 h）處理各樣品，以發酵液處理前含菌量為對照，計算各樣品活菌數，篩選出最佳干燥工藝。

1.2.6 菌制劑成品中菌株存活率 在100 mL 的SB13 發酵液中單獨加入10% 脫脂奶粉、10% 麥麩、及10% 脫脂奶粉+10% 麥麩混合樣，在100 mL 的BL14 發酵液中分別加入10% 脫脂奶粉、10% 麥麩及10%脫脂奶粉+10%麥麩混合樣，未處理發酵原液為對照，冷凍干燥制備出成品菌制劑待測樣品，計算存活率。

1.2.7 菌制劑體外胃腸模擬環境存活狀況分析 腸道模擬試驗：分別向450 mL 的胃液和胰液中加入50 mL 的SB13 號菌液；同樣方法處理BL14 菌。智能溶出實驗儀器設定溫度37 ℃，攪拌速度120 r·min-1，分別于0、2、4 h 時取出5 mL 樣品，獲得待測樣品，計算存活率，未處理發酵原液為對照，DNS法[14]檢測分析內切葡聚糖酶活力保持情況。

1.2.8 待測樣品存活率檢測計算 將上述各待測樣品定容至100 mL，取1 mL 加入9 mL 生理鹽水，稀釋至10-6，取0.1mL 稀釋液涂布于平板基礎培養基上，37 ℃恒溫培養24 h，計算處理后菌落數（B），以對應樣品處理前發酵液活菌數（A）為對照，根據公式：存活率/%=（B/A）×100，計算出各處理樣品的存活率。

1.2.9 菌制劑對高纖維物質的糖化力檢測 選取豬飼料、雞飼料和牛飼料為糖化標的，將各飼料按質量比1∶1 的比例加水混合均勻，分別稱取100 g 處理飼料接種5% 的各類菌制劑，置于37 ℃恒溫發酵，在0、2、9、12、24 h 取樣檢測總糖含量。

1.2.10 菌株BL14 對病原菌的抑制效果 采用抑菌圈法[28]檢測分析BL14 對各病原菌的抑制效果。

1.3 數據處理

試驗數據處理采用SPSS Statistics 軟件進行，方差分析采用單因素AVOVA 檢驗后進行LSD 多重比較。

2 結果與分析

2.1 最佳芽孢形成條件

由表1 可知菌株SB13 發酵至72 h 時，芽孢產生率最高，達到78.8%；菌株BL14 在發酵至48 h 時，芽孢產生率最高，達到70.99%；進一步地，將菌SB13和BL14 置于不同溫度中發酵48 h，獲得最佳芽孢形成發酵溫度為35 ℃，其芽孢形成率分別為92.48%和82.01%（表2）。

表1 不同培養時間的芽孢形成率Table 1 Bacillus sporulation under varied culture durations （單位：%）

表2 不同培養溫度條件下的芽孢形成率Table 2 Bacillus sporulation under varied culture temperatures （單位：%）

2.2 最佳保護劑篩選

由表3 可知，10%蔗糖對地衣芽孢桿菌BL14 保護效果最佳，經過常溫烘干后，菌的存活率可達91.10%，顯著高于其他處理；10%脫脂奶粉對枯草芽孢桿菌SB13 的保護效果最佳，存活率高達94.24%，顯著高于其他保護劑；進一步地，對最佳保護劑進行最適加入量的篩選（表4），獲得脫脂奶粉加入量為10% 時，菌SB13 烘干獲得的菌落數最大，為9.41 lg（cfu·mL-1）；蔗糖加入量為4.00%時，菌BL14 烘干獲得的菌落總數最大，為9.73 lg（cfu·mL-1）。

表4 最佳保護劑加入量篩選Table 4 Optimal addition of protective agent 單位：lg（cfu·mL-1）

2.3 載體篩選

由表5 可知，米糠、稻殼和淀粉對作為載體對地衣芽孢桿菌BL14 保護效果較好，三者間不存在顯著差異，但以淀粉為載體時，菌的存活率可達92.44%，因此選淀粉為BL14 的載體。麥麩、豆粕和稻殼對枯草芽孢桿菌SB13 的保護效果均較好，三者間未有顯著差異，但麥麩的存活率高達90.25%，因此選擇麥麩為菌SB13 的最佳載體；進一步地，進行載體最適加入量的篩選（表6），獲得麥麩加入量為10% 時，菌SB13 烘干獲得的菌落數最大為9.60 lg（cfu·mL-1）；淀粉加入量為10% 時，菌BL14 烘干獲得的菌落數最大，為9.61 lg（cfu·mL-1）。

表5 不同載體對菌存活率的影響Table 5 Survival rates of bacteria cultured in media containing different carriers （單位：%）

表6 最佳載體加入量篩選Table 6 Optimal addition of carrier 單位：lg（cfu·mL-1）

2.4 成品制備最佳工藝

由表7 可知，干燥條件較好的工藝為常溫干燥和冷凍干燥，由于常溫干燥容易使樣品出現結塊、干燥不均衡等問題，固采用冷凍干燥為最佳干燥工藝。

表7 不同干燥條件對菌存活率的影響Table 7 Bacteria survival rates under varied drying conditions （單位：%）

2.5 菌制劑成品中菌株存活率

由表8～9 可知，經過工藝優化后，SB13 存活率顯著提高，3 個處理間未見有顯著差異，加入脫脂奶粉+麥麩的混合物后菌SB13 的存活率可高達97.71%。單獨加入4% 蔗糖和10% 淀粉，以及加入蔗糖和淀粉保護劑混合保護后，與原液相比，BL14 存活率顯著提高，3 個處理間未見顯著差異，加入蔗糖+淀粉的混合物后菌BL14 的存活率可高達94.69%。

表8 幾種保護劑在冷凍干燥條件下SB13 存活情況Table 8 Bacteria survival rates of freeze-dried SB13 preparation with various protective agents

表9 幾種保護劑在冷凍干燥條件下菌BL14 存活情況Table 9 Bacteria survival rates of freeze-dried BL14 preparation with various protective agents

2.6 菌制劑體外胃腸模擬環境存活狀況分析

對菌制劑進行體外胃腸模擬環境存活狀況分析，結果（圖1）表明，經過人工模擬胃液處理后，SB13 和BL14 的存活率明顯下降，處理2 h 后，菌存活率分別為18.96%和22.29%，菌落數分別為2.55×107和3.8×107cfu·mL-1，內切葡聚糖酶酶活的保存率分別為42.59%和39.67%。經過人工模擬胰液環境后，SB13 的存活率顯著下降，處理2 h 和4 h 后，存活率分別為84.88%和43.80%，菌落數分別為11.00×107和5.65×107cfu·mL-1，內切葡聚糖酶酶活的保存率分別為87.50%和42.00%；BL14 受胰液影響較小，處理4 h 后，存活率高達84.94%，菌落數達13.30×107cfu·mL-1，內切葡聚糖酶活性保持率為77.46%，處于較高水平。

2.7 菌制劑對高纖維物質的糖化力檢測

內切葡聚糖酶具有降解纖維素的作用，在前期研究中發現以黃漿水為培養基時，SB13 和BL14 產內切葡聚糖酶的活性顯著高于基礎培養基[14]。為評價以黃漿水為基質時菌制劑對各飼料的吸收利用效率，本研究以基礎培養基為對照，進行菌制劑對飼料的糖化力分析，結果見表10。與未發酵（0 h）相比，經過2 h 發酵后，所有飼料的總糖含量都顯著上升，說明SB13 和BL14 對各飼料中的纖維素有糖化效果，添加菌制劑將有利于畜禽對飼料的吸收利用。兩種菌株發酵后，雞飼料在發酵2～12 h 總糖含量先后達到最高值，在發酵24 h 后，出現了顯著下降，推測總糖被菌株進一步代謝分解[14]；牛飼料發酵后，直到發酵24 h，牛飼料的總糖一直呈上升趨勢，這可能與牛飼料中纖維素含量高有關。比較兩種培養基對糖化作用的影響：以黃漿水為培養基時，SB13 在發酵2～24 h 時段，牛飼料的總糖含量顯著高于基礎培養基，表明采用黃漿水培養基制備的菌制劑可顯著提高SB13 對牛飼料的糖化力。

表10 酶菌制劑處理對飼料總糖含量的影響Table 10 Effect of preparation addition on total sugar content of feed （單位：mg·mL-1）

2.8 BL14 對病原菌的抑制效果

地衣芽孢桿菌具有抑菌作用，在畜禽養殖及日常生活中常替代抗生素應用于胃腸道腹瀉的治療。基于此，本研究分析地衣芽孢桿菌BL14 對常見致病菌的抑制性，結果見表11，該菌對金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑為14 mm，對單核細胞增生李斯特菌、奇異變形桿菌、大腸桿菌、宋內氏志賀細菌和鼠傷寒沙門氏菌沒有抑菌作用。

表11 菌BL14 對病原菌的抑制作用Table 11 Inhibitory effect of BL14 on pathogens

3 討論

菌制劑的生產成本和作用功效是決定其是否具備商業開發價值的主導因素。我國作為大豆加工和消費大國，每年因大豆加工產生的黃漿水數量巨大。以2018 年全國豆制品加工大豆700 萬t 計，一年產生黃漿水的量高達2 100 萬t 以上[29]。受含水率高、回收成本及商品回收率低等多重因素影響，目前對黃漿水的處理多采用直排的方式。本研究實現了黃漿水在芽孢桿菌制劑生產中的創新應用，不僅提高芽孢桿菌制劑中內切葡聚糖酶的含量，提高其對牛飼料的糖化力，還有利于節約菌制劑生產成本，顯示出其商業應用優勢。

菌制劑的應用效果與其實際含有的活菌數及芽孢數密切相關，對菌制劑有效生物量生產工藝進行研究優化，是提高其使用效果的關鍵因素。芽孢是芽孢桿菌類微生物在一定環境條件下的另一種存在方式，和菌體相比，其具有抗逆性強、耐酸堿、耐高溫、抗紫外線、耐酶、耐高溫、易儲藏的特性[16]。本研究對枯草芽孢桿菌SB13 和地衣芽孢桿菌BL14在黃漿水基質生長時的芽孢形成條件進行優化，獲得SB13 和BL14 最佳產孢培養時間分別為72 h 和48 h，最佳產孢溫度為35 ℃，通過優化可使菌SB13和BL14 的芽孢形成率分別達到92.48% 和82.01%，為后期干燥加工及儲藏提供保障。菌體干燥的過程會使菌體細胞膜融合，脂質相發生轉變[30]，而冷凍會導致菌體細胞膜脂肪及蛋白結構的改變。由于不同的微生物適合的保護劑成分和配方的差異，為避免干燥或凍干過程中的細胞損傷及干燥過程中的高有效生物量，需要對菌體加入保護劑以用于后期粉末狀菌制劑的干燥處理[30]。本研究根據已有的報道[28,31-32]，選取甘油等6 種保護劑對菌株進行干燥處理，獲得菌株SB13 和菌株BL14 的最適保護劑分別為脫脂奶粉和蔗糖，最適加入量分別為10%和4%。載體是最為常見的應用于微生物固定和附著的材料[33]。研究選取在畜禽飼料加工中常見的原料（麥耚、米糠、稻殼、豆粕、淀粉）為篩選對象，獲得SB13 和BL14 的最適載體分別為麥耚和淀粉，最適加入量均為10%。為獲得有效生物量較高的粉末型菌制劑，研究對兩種加入最適保護劑和載體的菌株進行了常溫烘干、噴霧干燥、冷凍干燥和60 ℃熱泵干燥處理，獲得兩種菌的最佳干燥工藝為冷凍干燥。經過菌制劑制備工藝的優化，獲得SB13 和BL14 菌制劑成品、其存活率最高分別達到97.71%和94.69%，顯著高于未優化工藝制備的菌制劑（存活率分別為37.5%和36.11%）。

高效的生物量是益生菌制劑發揮功效的關鍵，而其在到達大腸前，還需經過胃液（高酸環境，pH 3.0 左右）和十二指腸胰液（弱堿環境，pH 7.8～8.4），逗留時間在1～2 h[34-35]。因此，能否順利通過胃液的酸脅迫、胰液的堿脅迫是決定其發揮功能特性的關鍵因素。本研究中兩種菌制劑在人工模擬胃液處理2 h 后，菌落數分別為2.55×107和3.8×107cfu·mL-1；在人工胰液環境處理4 h 后，菌落數分別為5.65×107cfu·mL-1和13.3×107cfu·mL-1，均超過活菌發揮功能特性的菌數臨界值（106cfu·mL-1）[34]，說明其可以對畜禽發揮作用；經過處理后，兩種菌制劑的內切葡聚糖酶活保存率大于39%（胃液）和72%（胰液），說明其含有的內切葡聚糖可在腸道內發揮功效，有利于促進畜禽對飼料的吸收利用。由于研究采用的SB13 和BL14 具有高產內切葡聚糖酶的能力，經過對飼料的糖化力分析，證實兩種菌對雞飼料、豬飼料和牛飼料均有顯著的糖化作用，添加SB13 和BL14 菌制劑有利于畜禽對飼料的吸收利用效率。而BL14 對抑制金黃色葡萄球菌有顯著效果，可應用于畜禽感染金黃色葡萄球菌的預防與治理。