水稻褐飛虱若蟲和成蟲褪黑素含量測定及比較

施龍清，解振興，姜照偉，董 萌，占志雄

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建 福州 350018）

0 引言

【研究意義】褐飛虱Nilaparvata lugens（St?l）是水稻最主要害蟲之一。作為專食性昆蟲，一方面褐飛虱的若蟲和成蟲棲息在水稻莖基部刺吸汁液危害，另一方面雌蟲交配后將卵排列產(chǎn)于稻株韌皮部內(nèi)，破壞水稻疏導(dǎo)組織。危害嚴(yán)重時(shí)，稻株大面積枯萎倒伏塌陷，導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收。已知褪黑素在水稻中含量相對較高，且在重要激素合成和水稻抗性方面具有重要作用[1-3]。【前人研究進(jìn)展】褪黑素（melatonin），化學(xué)名稱為N-乙酰5-甲氧基色氨，為血清素（serotonin，5-羥色氨）的衍生物，是一種吲哚類內(nèi)分泌激素[4]。最早在牛的松果體中發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究證實(shí)所有脊椎動物體內(nèi)均存在有褪黑素，并且除松果體外，其他器官如視網(wǎng)膜、晶狀體、骨髓細(xì)胞、腸道及皮膚等也能夠分泌褪黑素[5]。1984 年，Vivien-Roel 等利用放射免疫法（Radioimmunoassay，RIA）從蝗蟲的復(fù)眼中檢測到褪黑素，首次證明褪黑素同樣存在于昆蟲體內(nèi)[6]。此后，陸續(xù)在半翅目（Hemiptera）、蜻蜓目（Odonata）、蜚蠊目（Blattodea）、直翅目（Orthoptera）、鱗翅目（Lepidoptera）、膜翅目（Hymenoptera）以及雙翅目（Diptera）等昆蟲中發(fā)現(xiàn)[7]。研究表明褪黑素在昆蟲晝夜節(jié)律、胚胎發(fā)育、蛻皮和繁殖等重要生命活動中不可或缺[8-11]。以果蠅Drosophila melanogaster為例，在人為注射褪黑素后，其交配速度和產(chǎn)卵量均顯著降低[12]。作為一種內(nèi)源性激素，褪黑素在昆蟲體內(nèi)的含量極低，且主要集中于頭部復(fù)眼內(nèi)[7,13]。如蝗蟲Locusta migratoria單只復(fù)眼的褪黑素含量僅有10.5～26.5 pg[6]，100 mg重量的豌豆蚜蟲Acyrthosiphon pisum褪黑素含量為52.5～78.0 pg[14]。昆蟲褪黑素檢測的方法包括放射免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和酶聯(lián)免疫法（euzymelinked immunosorbent assay，ELISA），以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）等[15-17]。相對來講，在這些方法中LC-MS 檢測具有靈敏度高、檢測速度快、費(fèi)用低、結(jié)果穩(wěn)定等特點(diǎn)，逐步成為檢測生物體褪黑素含量的主要方法。【本研究切入點(diǎn)】褐飛虱褪黑素的含量和作用機(jī)理尚待深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對1～5 齡若蟲和長短翅、雌雄成蟲的褪黑素含量進(jìn)行測定和比較，明確褪黑素在褐飛虱各發(fā)育階段的含量情況，為后續(xù)褪黑素作用機(jī)理研究提供方向和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：TG-16G 臺式高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)A1204 電子天平（精確度0.1 mg，上海衡際科學(xué)儀器有限公司），AGLIENT1290高效液相色譜儀（美國AGLIENT 公司），SCIEX-6500Qtrap 質(zhì)譜儀（MS/MS）（美國AB 公司），CHA-2氣浴恒溫?fù)u床（蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品公司），PS40A超聲清洗儀（深華泰科學(xué)儀器有限公司），水浴氮吹儀（上海那艾儀器有限公司）。

試劑：褪黑素（melatonin）標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司），甲醇、乙腈（色譜級，德國默克醫(yī)藥生物科技公司）。

1.2 標(biāo)曲溶液配制

取1 mg 褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品粉末，置于2 mL 甲醇中，震蕩溶解均勻，作為褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。取甲醇998 μL 于1.5 mL 離心管，加入500 μg·mL-1褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液2 μL，震蕩均勻，配制1 μg·mL-1的工作母液；母液繼續(xù)用甲醇稀釋至20.00、5.00、2.00、0.50、0.20、0.05 ng·mL-1系列標(biāo)曲溶液。

1.3 褐飛虱飼養(yǎng)及樣品收集

供試褐飛虱種源于2017 年夏季取自從福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所試驗(yàn)田，用臺中1 號（TN1）品種水稻苗在室內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：每日5:00～18:59光照，光照周期14L∶10D；室內(nèi)溫度（28±1 ）℃，相對濕度60%～70%。

收集同一批次羽化褐飛虱雌雄成蟲各約50 頭放入一個新養(yǎng)蟲籠內(nèi)。籠內(nèi)提供足量TN1 水稻新苗供雌蟲產(chǎn)卵。待卵孵化后，根據(jù)發(fā)育進(jìn)程，并參照丁錦華等[18]對褐飛虱若蟲齡期的鑒別方法，依次收集1～2 齡若蟲、3 齡若蟲、4 齡若蟲、5 齡若蟲、長翅雌性成蟲、長翅雄性成蟲、短翅雌性成蟲和短翅雄性成蟲共8 個蟲態(tài)褐飛虱，每個蟲態(tài)取3 份樣，每份樣品重量不低于100 mg，收集時(shí)間段均在14:00～15:00。蟲樣裝于1.5 mL 離心管后保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.4 樣品前處理

稱取0.02 g 樣品，加入約10 倍體積二氯甲烷，用一次性研磨棒研磨后在4 ℃下浸泡過夜，12 000 g、4 ℃離心5 min，取下層二氯甲烷相；上層物質(zhì)取出后加入二氯甲烷再度浸泡過夜，離心取二氯甲烷相，合并兩次提取的二氯甲烷相，氮?dú)獯抵两桑?00 μL 甲醇復(fù)溶后過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，定容至200 μL，-20 ℃保存待測。

1.5 HPLC-MS/MS 檢測條件

液相條件：色譜柱為poroshell 120 SB-C18 反相色譜柱（2.1×150，2.7 μm）；柱溫30 ℃。

流動相：A:B=（甲醇/0.1% 甲酸）:（水/0.1%甲酸）；洗脫梯度:0～1.0 min，50%；1.0～3.0 min，50%～80%；3.0～3.1 min，80%～50%；3.1～6.0 min，50%。流速300 μL·min-1；進(jìn)樣量2 μL；分析時(shí)間6 min。

質(zhì)譜條件：電離方式采用ESI 正負(fù)離子模式分別監(jiān)測；掃描類型MRM；氣簾氣25 psi；

噴霧電壓：+3 500 V；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力65 psi；霧化溫度450 ℃。

褪黑素反應(yīng)監(jiān)測條件見表1。褪黑素分子量為233，電噴霧電離正離子模式，質(zhì)子化后母離子[M+H]+為233，選為定性離子。隨后碰撞過程中會丟失NH4CO2，形成主要碎片m/z174.1，選為定性離子。褪黑素出峰保留時(shí)間為3.38 min。

表1 褪黑素質(zhì)子化或去質(zhì)子化的選擇反應(yīng)監(jiān)測條件（[M+H]+或[M-H]-）Table 1 Conditions for monitoring protonated [M+H]+ or deprotonated [M-H]- melatonin reactions

1.6 數(shù)據(jù)分析

儀器所測得含量為最終提取液的含量，經(jīng)計(jì)算獲得原樣品中激素含量，計(jì)算方法如下：

樣品中褪黑素含量（ng·g-1）=[ 檢測含量（ng·mL-1）×稀釋體積（mL）]/稱取質(zhì)量（g）

式中：稀釋體積為樣品最終溶解進(jìn)樣時(shí)所用的溶液體積；稱取質(zhì)量為提取時(shí)的取樣質(zhì)量；檢測含量由待測物質(zhì)峰面積代入標(biāo)曲方程計(jì)算求得。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測定3 次，取平均值。應(yīng)用SPSS 22.0、Microsoft Excel 2010 以 及OriginPro 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素標(biāo)準(zhǔn)曲線

20.00、5.00、2.00、0.50、0.20、0.05 ng·mL-16 個標(biāo)曲溶液以平均峰面積為縱坐標(biāo)（y），褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程y=135 403x+10 164，R2=0.999，峰面積與含量呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，可用于定量分析（圖1）。

圖1 褪黑素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of melatonin

2.2 各齡期褐飛虱若蟲褪黑素含量比較

如圖2 所示，在若蟲階段，1～2 齡褐飛虱若蟲的褪黑素含量均值最低，為378.5 pg·g-1，進(jìn)入3 齡后褪黑素含量快速上升并達(dá)到若蟲階段的峰值（均值856.6 pg·g-1），4 齡、5 齡時(shí)褪黑素含量逐漸下降，均值分別為810.7 pg·g-1和574.5 pg·g-1，但5 齡若蟲褪黑素含量仍顯著高于1～2 齡。3 齡和4 齡若蟲間褪黑素含量無顯著差異，但顯著高于1～2 齡和5 齡時(shí)期若蟲褪黑素含量（圖2）。

2.3 各齡期褐飛虱若蟲褪黑素含量比較

若蟲羽化為成蟲后，雌、雄褐飛虱的褪黑素含量出現(xiàn)極端分化（圖3）：以性別（雌、雄）和翅型（長翅、短翅）為變量，對成蟲階段褪黑素含量進(jìn)行雙因素方差分析（Two-way ANOVA）。結(jié)果表明，褐飛虱成蟲雌雄間褪黑素含量差異顯著（df=1,8；F=630.083；P＜0.001），而長、短翅型間的差異不明顯（df=1,8；F=1.854；P=0.210）。性別和翅型間的交互效應(yīng)不顯著（df=1,8；F=2.630；P=0.144）。長、短翅雄性成蟲褪黑素含量上升明顯，均值分別為978.3 pg·g-1和969.6 pg·g-1，高于若蟲階段褪黑素峰值（3 齡若蟲）；長、短翅雌性成蟲褪黑素含量則急劇下降，均值分別為76.1 pg·g-1和176.8 pg·g-1，不足雄性成蟲的四分之一。單因素方差分析及LSD多重比較結(jié)果表明，雄性長、短翅成蟲褪黑素含量無顯著差異，與雌性兩個翅型成蟲相比差異極顯著（P＜0.01）（圖3）。

圖3 褐飛虱成蟲褪黑素含量比較Fig.3 Melatonin contents of adult N.lugens

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，褐飛虱整個生長發(fā)育期體內(nèi)褪黑素含量范圍在76.1～978.3 pg·g-1，若蟲體內(nèi)褪黑素含量的峰值為856.6 pg·g-1，出現(xiàn)在3 齡后，隨后逐漸下降，羽化后的成蟲體內(nèi)褪黑素含量受性別影響極端分化，雄蟲體內(nèi)所含褪黑素約是雌蟲的5～12倍，分別為長翅雌蟲76.1 pg·g-1、長翅雄蟲978.3 pg·g-1、短翅雌蟲176.8 pg·g-1、短翅雄蟲969.6 pg·g-1，這表明褐飛虱體內(nèi)的褪黑素含量具有顯著的性別間差異。前人發(fā)現(xiàn)昆蟲體內(nèi)的褪黑素主要集中在頭部[6,12]，且相較植物中的褪黑素含量，昆蟲體內(nèi)的褪黑素含量極少，更加難以檢測。褐飛虱一二齡若蟲個體微小，若僅針對其頭部進(jìn)行褪黑素測定，難度和誤差均較大，因而本試驗(yàn)整體進(jìn)行褪黑素的提取。

褐飛虱為半變態(tài)昆蟲，若蟲具有5 個齡期，從若蟲到成蟲共經(jīng)歷5 次蛻皮，而蛻皮激素是控制其蛻皮的關(guān)鍵因素[18]。已有的研究證實(shí)，褪黑素可促進(jìn)美洲大蠊Periplaneta americana（L.）促前胸腺激素分泌，進(jìn)而刺激蛻皮激素合成[11]。在本研究中，3～5 齡褐飛虱若蟲保持相對較高的褪黑素含量，這對蛻皮激素的合成有利。本研究另一個重要的發(fā)現(xiàn)是褐飛虱雌雄成蟲間褪黑素的含量存在極顯著差異。在對蟋蟀Acheta domesticus的研究中發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以調(diào)控其移動行為規(guī)律[19]。褐飛虱的求偶交配過程遵循“call-fly”策略，即雄性成蟲表現(xiàn)活躍，四處搜尋并發(fā)出振動信號通過寄主進(jìn)行傳遞，雌性接收信號后靜止不動并以特有振動信號進(jìn)行回復(fù)，收到反饋的雄性對雌性進(jìn)行定位并移動接近[20]。在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)雄性褐飛虱的移動量顯著高于雌性[21]，推測褪黑素對褐飛虱成蟲的移動行為起調(diào)控作用。另有研究指出，褪黑素對卵巢發(fā)育具有抑制作用[22]，因此褐飛虱雌性成蟲褪黑素含量低也有利于卵巢發(fā)育。后續(xù)我們將開展褪黑素對褐飛虱移動行為和卵巢發(fā)育的調(diào)控研究。