IFITM2在胃癌組織中的表達及其對胃癌細胞遷移和侵襲的影響

劉勇剛 黃俊勇 李 曦 羅美華

南方醫科大學順德醫院 （佛山市順德區第一人民醫院）腫瘤科，廣東佛山 528300

胃癌是全球病死率最高的腫瘤之一。由于早期癥狀隱匿，大部分患者確診時已屬于中晚期，5年生存率低于20%[1]。腫瘤的局部復發和轉移是胃癌患者預后差的主要因素之一[2]，但確切的分子機制尚未清楚。

干擾素誘導跨膜蛋白家族（interferon-induced transmembrane proteins，IFITMs）共 有 4個 功 能性成員包括 IFITM1、IFITM2、IFITM3和 IFITM5，而IFITM4被證實是無功能的假基因[3]。目前，對于該家族的研究主要集中于抗病毒作用方面，其通過阻止病毒進入細胞內并抑制病毒在細胞內復制的作用[4-5]。研究發現，IFITMs中的IFITM1、IFITM3均可通過介導上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的過程促進胃癌細胞的遷移和侵襲[6-7]。但針對IFITM2在胃癌中的研究鮮見報道。本研究探討IFITM2在胃癌組織中的表達情況及其對胃癌細胞遷移和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例資料 收集2012年1月至2015年1月我院收治的54例胃癌患者癌組織及對應的癌旁組織樣本，其中男32例，女22例，平均年齡（50.67±7.35）歲，Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期43例。所有組織標本取出后即刻冷凍于液氮中，保存在-80℃環境中。所有入選患者術前均未接受相關治療?；颊咝g后總生存期時間為手術后至胃癌相關疾病死亡時間，所有患者術后隨訪5年。本研究獲得南方醫科大學順德醫院醫學倫理委員會批準，并由每位患者簽署知情同意書。

1.1.2 細胞及試劑 免疫組織化學試劑盒購自西寶生物科技（上海）股份有限公司，GES-1及MKN45購自中國科學院上海生物工程研究中心，胎牛血清、RPMI1640培養基、PBS緩沖液、蘇木素購自美國Hycolon公司，6孔培養板購自上海廣銳生物科技有限公司，Lipofectamine 3000轉染試劑購自南京森貝伽生物科技有限公司，RNA提取試劑盒購自日本Takara公司，IFITM2、E-cadherin、Vimentin、GAPDH抗體購自美國CST公司，IFITM2沉默質粒購自上海吉瑪基因公司。

1.2 方法

研究胃癌組織及細胞中IFITM2表達水平

1.2.1 免疫組化檢測蛋白表達水平 組織切片按標準實驗步驟操作，IFITM2一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS清洗3次后，室溫二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明后進行封片、晾干分析。所有染色結果均由兩位病理科醫師單獨評估判定。

1.2.2 細胞培養 在37℃、體積分數為5% CO2培養箱中，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養，2～3 d進行一次傳代。

1.2.3 細胞轉染 取對數生長期細胞3 ml種植于6孔培養板中，培養12 h后采用Lipofeetmnine 3000將200 pmol siRNA轉染至細胞內，6 h后更換新鮮培養基繼續培養48 h，進行下一步實驗。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測基因表達水平 按照試劑盒說明書操作，分別提取胃癌組織、細胞中總RNA，采用SYBR Green法進行real-time PCR反應，擴增反應條件設置為：在95℃預變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共進行40個循環。

1.2.5 蛋白印跡法（western blot）檢測蛋白表達水平 將蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜，5% BSA室溫封閉1 h后加入一抗在4℃冰箱孵育過夜，室溫下二抗孵育1 h，采用ECL發光顯示實驗結果。使用Image J軟件計算目的蛋白的相對表達水平。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 消化腫瘤細胞后平鋪于6孔板中，轉染24 h后進行劃痕，加入含5%胎牛血清的RIPM 1640繼續培養。劃痕后0、48 h進行顯微鏡下拍照。通過測量殘留劃痕寬度的方法來計算劃痕修復率。每組實驗重復3次。

1.2.7 侵襲實驗（transwell）檢測細胞侵襲能力 將1.0×105個腫瘤細胞加入上室，同時加入200 μl不含胎牛血清的培養基，將400 μl含10%胎牛血清加入下室，放入培養箱中孵育48 h，進行細胞固定、染色，并計算細胞總數。每組實驗重復3次。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以（）表示，采用t檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗。計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFITM2在胃癌組織及細胞中的表達水平

與癌旁組織相比，胃癌組織中IFITM2的表達水平明顯升高，mRNA相對表達量分別（0.612±0.114）、（1.239±0.156）（t=-12.436，P=0.005），見圖1A。與GES-1細胞相比（mRNA表達水平標準化為1后進行統計），MKN45中IFITM2 mRNA 的表達水平為（2.893±0.136）（t=-15.386，P=0.003），見圖 1B。

圖1 胃癌組織及細胞中IFITM2的表達水平

2.2 IFITM2的表達情況與胃癌患者臨床病理特征及預后的關系

分析54例胃癌組織中IFITM2 mRNA的表達水平，將高于中位值定為高表達組，而低于或等于中位值定為低表達組。結果發現IFITM2的表達水平與TNM分期、浸潤程度、淋巴結及遠處轉移相關（P＜ 0.05），與性別、年齡和腫瘤分化程度無關（P＞0.05）。見表 1。

表1 IFITM2 mRNA的表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關系（n=54）

2.3 IFITM2與胃癌患者預后關系

通過Kaplan-Meier繪制生存曲線分析，低表達組5年總生存率為22%，高表達組為50%，結果表明高表達IFITM2與患者預后不良顯著相關（χ2=8.166，P=0.0043），見圖 2。

圖2 胃癌患者IFITM2低、高表達組的生存曲線

2.4 沉默IFITM2表達對胃癌細胞MKN45遷移及侵襲的影響

與對照組相比（mRNA表達水平標準化為1后進行統計），siFIFTM2 mRNA（0.286±0.045）表達下調（t=-2.635，P=0.037），見圖 3A；與對照組（1.203±0.048）相比，siFIFTM2蛋白（0.302±0.051）表達水平下調（t=-2.755，P=0.024），見圖 3B。與對照組相比（遷移系數標準化為1后進行統計），siRNA-IFITM2組 中 遷 移 系 數（0.263±0.089）下 降（t=-2.916，P=0.034），見 圖 3C；對 照 組 與siFIFTM2組侵襲的細胞數為（332.667±26.398）、（116.391±18.904）（t=-6.947，P=0.024），見圖 3D。

圖3 沉默IFITM2表達對MKN45遷移及侵襲的影響

2.5 沉默IFITM2后對MKN45細胞中 E-cadherin、Vimentin表達的影響

與對照組相比，siRNA-IFITM2組中E-cadherin mRAN（1.863±0.217）表達上調（t=-3.135，P=0.026），Vimentin的 相 對 表 達 水 平 為（0.289±0.0987）（t=3.644，P=0.018），見圖 4A。對照組與 siRNAIFITM2組E-cadherin蛋白相對表達量分別為（0.813±0.108）、（1.307±0.116）（t=-2.635，P=0.038）；對照組與siRNA-IFITM2組Vimentin蛋 白 相 對 表 達 量 分 別 為（0.736±0.114）、（0.326±0.098）（t=2.842，P=0.035），見圖 4B。

圖4 沉默IFITM2對MKN45中E-cadherin、Vimentin表達的影響

3 討論

胃癌是我國高發病率和高病死率的消化道惡性腫瘤之一，大部分胃癌患者就診時已處于局部晚期或出現遠處轉移[8]。近年來，雖然治療胃癌的方法不斷改善，但胃癌的病死率卻仍然較高[9]。影響患者生存預后的主要因素表現在通過血管和淋巴管導致的遠處轉移[10]，但其具體機制尚未完全明確。因此，尋找調控其侵襲和轉移的關鍵分子，有望為臨床改善胃癌患者預后提供新的治療策略。

EMT過程涉及了E-cadherin、Vimentin等蛋白的參與，通過失去上皮樣細胞的特性及獲得間質樣細胞的表型而促進腫瘤進展[11]。EMT改變了細胞原有的形態，并促使細胞與細胞基質間相互作用，調節細胞外基質，使細胞更具有侵襲性。另一方面，E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白的異常表達又可以促使腫瘤細胞的EMT趨勢，降低細胞間相互聯系，促進腫瘤細胞侵襲及轉移[12]。研究發現IFITMs參與腫瘤的發生發展，并往往扮演促癌基因的角色，如Ogony等[13]發現在三陰性乳腺癌中STAT2/BRG1復合體通過發生相互作用，激活IFITM1表達，促進三陰性乳腺癌的侵襲表型；肺腺癌中，干擾IFITM3后腫瘤細胞的增殖、遷移能力受到抑制[14]，Xu等[15]研究發現胰島素生長因子通過胰島素生長因子1受體/轉錄因子STAT3通路可以部分激活IFITM2表達；同時，激活的IFITM2又可以調節白細胞介素6的表達及分泌促進胃癌細胞的增殖。然而，目前針對IFITM2在胃癌中的研究極少報道。

本研究發現，IFITM2在胃癌組織及細胞中明顯高表達（P＜0.01），其表達水平與腫瘤TNM分期、浸潤程度、淋巴結及遠處轉移情況顯著相關（P＜0.05）。通過Kaplan-Meier生存分析發現，高表達的IFITM2與胃癌患者的預后不良顯著相關（P＜0.01）。進一步通過劃痕及Transwell實驗分析siRNA-IFITM2組和對照組中細胞數量，發現沉默IFITM2的胃癌細胞遷移和侵襲的數目顯著減少（P＜0.05），表明沉默IFTM2的表達能顯著抑制MKN45細胞的遷移和侵襲能力。并且發現沉默IFITM2后，E-cadherin的mRNA及蛋白的表達水平顯著上調（P＜0.05），Vimentin的mRNA及蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05），提示IFITM2通過調控E-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平，促進MKN45細胞的EMT進程，從而增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。

綜上所述，IFITM2可能作為胃癌的促癌基因之一，有望成為其治療的潛在靶點，具體機制有待于進一步的實驗研究闡明。