HPLC法測定蒙成藥塔斯音-10中胡椒堿的含量

劉晶晶 李玉華

內蒙古自治區通遼市食品藥品檢驗所，內蒙古 通遼 028000

塔斯音-10由蓽撥、雕糞炭、寒水石(煅)、萬年灰(制)、鐵線透骨草、全石榴、干姜、光明鹽、蘇格木勒、肉桂等10味藥組成[1]，主治胃火衰弱、胃寒食積、消化不良等[2]。蓽茇為胡椒科植物蓽茇PiperlongumL. 的干燥近成熟果穗，作為中、蒙藥常用藥材，近些年來藥理研究發現蓽撥中所含胡椒堿Piperine具有抗氧化、抗炎殺菌、抗腫瘤、鎮靜、抗焦慮、抗胃潰瘍、降血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用[3-4]。作為臨床常用的蒙藥醫院制劑，目前為止，塔斯音-10質量控制方面的標準嚴重缺失，只有簡單的外觀性狀和檢查項目[2]。建立塔斯音-10主要藥效成份胡椒堿含量測定的方法，能有效控制該成藥的內在質量，為該成藥質量標準的提升提供參考。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀，Shimadzu LC-2030C液相色譜儀，InertSustain AQ-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。92SM-202A型電子天平，XS3DU電子天平，KQ5200DE超聲波清洗機。

1.2 試藥 對照品胡椒堿(批號：110775—201706，98.9%)由中國食品藥品檢定研究院所提供；樣品塔斯音-10來源：1號樣品(批號：20190909)由通遼市蒙醫整骨醫院提供；2號樣品(批號：20181221)由庫倫旗蒙醫院制劑室提供；3號樣品(批號：20190223)由內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供。水為高純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 HPLC 方法學考察

2.1 色譜條件[5]色譜柱：InertSustain AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Sepax Bio C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長343 nm。流動相：甲醇-水(77∶23)，流速為1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取胡椒堿對照品10.32 mg，置100 mL棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，精密量取1 mL置10 mL棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻即得胡椒堿對照品溶液(10.32 μg·mL-1)。

2.3 供試品溶液配制[6]取本品粉末(過四號篩)約0.1 g，精密稱定，置具塞棕色瓶中，精密加入無水乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 Hz)30 min，放冷，再稱定重量，用無水乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 取按處方比例制備的不含胡椒堿藥材的陰性對照供試品，按2.3項下供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果陰性對照色譜圖中在與胡椒堿對照品以及供試品色譜圖相對應的保留時間處無色譜峰出現，表明該方法專屬性強，其他組分對胡椒堿的測定無干擾。色譜圖如圖1所示。

A. 陰性樣品； B.對照品； C.供試品圖1 HPLC色譜圖

2.5 線性關系考察 精密稱取胡椒堿對照品0.00645 g，置25 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為胡椒堿對照品儲備液(258 μg·mL-1)。精密吸取該貯備液40、200、400、600、800、1000 μL，分別置于10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋定容后得到含有1.032 μg·mL-1、5.16 μg·mL-1、10.32 μg·mL-1、15.48 μg·mL-1、20.64 μg·mL-1、25.8 μg·mL-1的胡椒堿對照品系列濃度溶液。精密量取上述各濃度的標準溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品峰面積Y為縱坐標，相應的對照的量X為橫坐標，進行線性回歸。得到胡椒堿回歸方程為：Y=71998X，r=0.9993，表明胡椒堿在0.0103～0.2580 μg范圍內具有良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 按2.3項下供試品溶液配制方法，精密稱取內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供，批號為20190223的樣品約0.1012 g，配制成精密度試驗溶液，精密吸取樣品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，重復進樣6次，測得峰面積的RSD值為0.36%，表明該方法精密度良好。

2.7 穩定性試驗 精密稱取內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供，批號為20190223的樣品約0.1012 g，按2.3項下供試品溶液制備方法配制穩定性試驗溶液，室溫放置，分別在0、1、3、6、12、24 h進樣，記錄譜圖，測得峰面積。結果24 h內峰面積的RSD值為0.59%，表明該方法提取的樣品溶液在24 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗 取內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供，批號為20190223的樣品6份，每份約0.1 g，精密稱定，按2.3項下供試品溶液制備方法配制重復性試驗溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算含量，結果6份平行樣的含量RSD值為1.48%。表明該方法重復性良好。

2.9 準確度及范圍[7-8]取已知含量的樣品(內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供的，批號為20190223)9份，每份約0.05 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，分別加入2.5項下胡椒堿對照品貯備液380 μL、650 μL、1105 μL，按2.3項下供試品溶液制備方法制成加標回收溶液，配制成高、中、低三個濃度的加樣回收溶液，精密量取上述9份樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算回收率，結果見表1。三個濃度加標回收率平均值為99.86%，RSD值為0.76%。表明胡椒堿含量在1.9～5.7 μg·mL-1范圍內測得的結果準確可靠。

表1 回收率試驗結果 (n=9)

2.10 不同色譜柱和儀器設備的耐用性試驗 換不同廠家、不同型號的色譜柱及不同的液相色譜儀，取內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供，批號為20190223的樣品，精密稱定，按2.3項下供試品溶液配制方法配制樣品溶液，精密吸取該樣品溶液和2.2項下的對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計算樣品中胡椒堿含量。結果見表2。

表2 不同色譜柱、不同儀器的耐用性試驗

從表中數據可以看出，胡椒堿的含量變化不大(RSD值0.89%)，表明該方法對不同色譜柱和儀器設備耐用性良好。

3 樣品含量測定[9-10]

分別取三個廠家提供的塔斯音-10樣品粉末約0.1 g，精密稱定，按2.3項下供試品溶液制備方法提取制備樣品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，測定結果見表3。

表3 3批蓽茇藥材中胡椒堿含量測定結果 (n=3)

4 討論

成藥粉末以甲醇和無水乙醇作為提取溶劑進行超聲提取(功率120 W，頻率40 kHz)，結果無水乙醇提取效率高于甲醇，故提取溶劑定為無水乙醇。為保證胡椒堿成分提取完全，實驗中考察了超聲提取15 min、30 min和60 min，結果胡椒堿的含量基本一致(RSD 0.31%)，故提取時間定為30 min。

柱溫對胡椒堿與其它干擾組分的分離度影響較大。柱溫40 ℃時胡椒堿拖尾嚴重，與相鄰干擾組分峰分離度變小(R值為1.218，小于1.5)，分不開。柱溫調整至30 ℃時，胡椒堿拖尾因子變小，與相鄰組分分離度變大，分離較好(R值為1.653)。故將柱溫設定為30 ℃。

本實驗通過專屬性、精密度、穩定性、重復性試驗、不同色譜柱及儀器設備的耐用性考察，結果表明該方法準確可靠，可作為塔斯音-10中胡椒堿含量測定的方法。