鐵必康膠囊的質量標準提高研究

金 麗 杭 娟 張曉丹

無錫聯勤保障中心藥品儀器監督檢驗站，江蘇 南京 210002

鐵必康膠囊由磁石、骨碎補、葛根、黃精、枸杞子、熟地黃、漏蘆、石菖蒲和酒大黃9味藥組成，為上海長征醫院的非標準復方制劑，具有補腎健脾、益氣活血的作用。臨床主要用于治療慢性缺鐵性耳聾以及與鐵代謝障礙相關的各類非感染性、非遺傳性感音神經性耳聾或梅尼埃病引起的耳鳴、耳聾與眩暈等。該制劑原質量標準過于簡單，僅設置了骨碎補和葛根的薄層色譜鑒別，且未設置含量測定項。為了更有力地控制該制劑的內在質量，提高質量標準，在原標準基礎上，本文修訂了葛根的薄層色譜鑒別，刪除了原標準中骨碎補的鑒別，并新增了大黃和枸杞子的鑒別。同時，以該制劑中葛根的主要有效成分——葛根素為指標，新增高效液相色譜法測定其含量，控制其內在質量，以保證臨床用藥的有效性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)、MS105 電子天平、AL104電子天平(Mettler Toledo)、KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、HH-6數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

1.2 試藥 葛根對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121551-201103)、大黃對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：120984-201202)、枸杞子對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121072-201410)、葛根素對照品(純度：95.5%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201318)、大黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110756-200110)、大黃酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110796-201319)；鐵必康膠囊(規格：0.6 g/粒，上海長征醫院，批號：171026，170912，170916)，陰性對照樣品由上海長征醫院提供；硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 葛根的鑒別[1-3]取本品10粒的內容物，加甲醇50 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，加等量乙酸乙酯提取2次，棄去乙酸乙酯液，水層再加等量的正丁醇振搖提取2次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取葛根對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，放置2 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為對照藥材溶液。取按樣品同樣工藝制備而成的缺葛根的陰性樣品6 g，按照供試品溶液的制備方法制備缺葛根的陰性對照溶液。照薄層色譜法[4](通則0502)試驗，吸取供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL，對照藥材溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏15 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。結果如圖1所示。

2.1.2 大黃的鑒別[1,3,5]取本品10粒的內容物，加甲醇50 mL，浸漬1 h，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加20 mL水使溶解，加鹽酸2 mL，置水浴中加熱30 min后，立即冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。取大黃酚和大黃素對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。取按樣品同樣工藝制備而成的缺大黃的陰性樣品6 g，按照供試品溶液的制備方法制備缺大黃的陰性對照溶液。照薄層色譜法[4](通則0502)試驗，吸取供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL、大黃對照藥材溶液1 μL、大黃酚對照品溶液2 μL、大黃素對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點；置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，顯相同的紅色斑點，陰性對照無干擾。結果如圖2所示。

2.1.3 枸杞子的鑒別[1,6]取本品10粒，內容物加水50 mL，煮沸10 min，離心(3000轉/min)10 min，取上清液，加乙酸乙酯振搖萃取2次，每次30 mL，分取乙酸乙酯液，濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取枸杞子對照藥材0.5 g，加水35 mL，煮沸15 min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖萃取2次，每次15 mL，分取乙酸乙酯液，濃縮至1mL，作為對照藥材溶液。取按樣品同樣工藝制備而成的缺枸杞子的陰性樣品6 g，按照供試品溶液的制備方法制備缺枸杞子的陰性對照溶液。照薄層色譜法[4](通則0502)試驗，吸取對照藥材溶液5 μL、供試品溶液10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15∶8∶1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。結果如圖3所示。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件[7-12]色譜柱：Dubhe C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(25∶75)；檢測波長：250 nm ；理論塔板數按葛根素峰計算不低于2500。

2.2.2 溶液的制備 ①對照品儲備液:稱取葛根素對照品約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加稀乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。②對照品溶液：精密量取對照品儲備液2 mL，置于10 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。③供試品溶液：取裝量差異項下的本品內容物，混勻，研細，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。④陰性對照溶液:按處方比例稱取缺葛根的其余藥味，按鐵必康膠囊制備工藝制備陰性樣品，然后按2.2.2③項下方法操作，制備陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗 取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各5 μL，按2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的保留時間處有同一色譜峰，而陰性對照溶液在相應保留時間處則無色譜峰出現，表明鐵必康膠囊中其他成分對葛根素的測定無干擾。結果如圖4所示。

2.2.4 線性關系的考察 取葛根素對照品約12.5 mg，精密稱定(12.48 mg)，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為葛根素對照品儲備液。分別精密葛根素儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置10 mL容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，按2.2.1項下色譜條件進行測定，以對照品濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得到回歸方程為：

Y=21113X-3620.6，r=1.0000，n=6

結果表明：葛根素濃度在23.84～143.02 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 取葛根素對照品約10 mg，精密稱定(9.51 mg)，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為葛根素對照品儲備液。精密量取葛根素儲備液5.0 mL，置10 mL容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，按2.2.1項下色譜條件連續進樣6次，葛根素峰面積的RSD為0.28%。結果表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取樣品(批號：170916)，按2.2.2③項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，分別于0、2、4、6、8、10和12 h進樣，記錄葛根素峰面積，得峰面積的RSD為0.60 %，結果表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批號樣品6份(批號：170916)，按2.2.2③項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，記錄葛根素峰面積，按外標法計算葛根素的含量，測得其平均含量為7.2911mg·g-1，RSD為0.31%(見表1)，結果表明本方法重復性良好。

表1 重復性試驗結果

2.2.8 加樣回收率 稱取6份已知含量的樣品(批號：170916，葛根素含量為7.2911 mg·g-1)，各約0.3 g，精密稱定，分別加入濃度為0.1906 mg·mL-1的對照品溶液(精密稱取葛根素對照品22.88 mg，置100 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得)10 mL，按2.2.2③項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，記錄葛根素峰面積，按外標法計算葛根素的含量，結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果

2.2.9 耐用性試驗 流動相比例的考察：取樣品(批號：170916)，按2.2.2③項下方法制備供試品溶液，調節流動相比例，按2.2.1項下色譜條件測定，記錄葛根素峰面積，按外標法計算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g)。結果表明，流動相中甲醇的比例增大對含量測定結果影響相對更大些，但基本能剛好滿足樣品檢測的要求，見表3。

色譜柱的考察：取樣品(批號：170916)，使用不同品牌的色譜柱，按2.2.2③項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，記錄葛根素峰面積，按外標法計算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g)。結果表明，不同色譜柱對含量測定結果影響很小，見表4。

表3 流動相比例試驗結果

表4 流動相比例試驗結果

柱溫的考察：取樣品(批號：170916)，在不同柱溫下，按2.2.2③項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件測定，記錄葛根素峰面積，按外標法計算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g)。結果表明，不同的柱溫對含量測定結果影響很小，見表5。

表5 柱溫試驗結果

流速的考察：取樣品(批號：170916)，在不同流速下，按2.2.2③項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件測定，記錄葛根素峰面積，按外標法計算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g)。結果表明，不同的流速對含量測定結果影響很小，見表6。

表6 流速試驗結果

以上結果表明該方法有較好的耐用性。

2.2.10 含量測定 取3批樣品，按2.2.2③項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，記錄葛根素峰面積，按外標法計算含量。結果見表7。

表7 鐵必康膠囊中葛根素含量測定結果

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

3.1.1 磁石 磁石是一種氧化物類礦物尖晶石族磁鐵礦，主含四氧化三鐵，因此，本試驗嘗試利用鐵鹽的鑒別反應對其鑒別。參照文獻[13]和鐵鹽的一般鑒別方法[4](通則0301)，對磁石進行化學鑒別。實驗結果發現，陰性樣品對磁石的鑒別存在干擾。因此，磁石未能納入質量標準。

3.1.2 骨碎補 原質量標準中設置了骨碎補的薄層色譜鑒別，但通過實驗發現，供試品色譜中未能檢出相應斑點。參考現行版藥典[1]和相關文獻[14-16]，采用多種預處理方法(正丁醇萃取、過大孔樹脂柱等)嘗試對制劑中的骨碎補進行薄層色譜鑒別，均未能檢出相應斑點。這可能與骨碎補主成分柚皮苷的性質有關。柚皮苷在水中的溶解度為0.1%，75℃時也僅可達10%，結合該制劑水煮醇沉的生產工藝，考慮可能柚皮苷的轉移率過低，難以鑒別。因此，骨碎補未能納入質量標準。

3.1.3 石菖蒲和黃精 石菖蒲和黃精為方中臣藥，原標準均未建立它們的薄層色譜鑒別方法。參考文獻和藥典收載的石菖蒲和黃精相關鑒別方法[1,17-18]，采用對照藥材法，對該制劑中的石菖蒲和黃精進行了鑒別。但實驗結果發現，供試品色譜中未能檢出與相應對照藥材色譜相對應的斑點。因此，石菖蒲和黃精均未能納入質量標準。

3.2 含量測定

3.2.1 指標成分的選擇 鐵必康膠囊處方中的君藥為磁石和骨碎補，磁石是一種氧化物類礦物尖晶石族磁鐵礦，主含四氧化三鐵，藥典收載的磁石含鐵量的測定方法為重鉻酸鉀滴定法。由于中成藥的組分多，制成的滴定用供試品溶液顏色深，嚴重干擾滴定終點顏色的判斷，且各中藥組分的重金屬含量也會影響滴定的結果，因此含鐵量不宜作為該制劑的定量指標；骨碎補的有效成分為柚皮苷，其水溶性差，且含量低，經過該制劑水提醇沉的工藝后該成分的損耗更大，在前期的薄層色譜鑒別研究中未能檢出該成分，而用高效液相色譜法[1,16]預試驗亦未能檢出，因此，骨碎補中的主成分柚皮苷亦不宜作為該制劑的定量指標。鑒于以上情況，根據君臣佐使的原則，考慮選擇葛根的有效成分葛根素來控制制劑的有效性。

3.2.2 提取方法及條件的選擇 在樣品提取條件及方法的研究中，按正交表L9(34)設計了正交試驗，考察了四個因素：提取方法(超聲、加熱回流、振搖)、溶劑種類(50%甲醇、稀乙醇、30%乙醇)、溶劑量(40、50、60 mL)和提取時間(30、60、90 min)對提取效率的影響。結果表明，最佳提取條件為：以40 mL稀乙醇為提取溶劑，超聲提取1 h。考慮到精密加入溶劑的準確性，選擇溶劑量為50 mL，最終采用稀乙醇50 mL超聲提取1小鐘制備供試品溶液。

3.2.3 流動相的選擇 參考相關文獻[1,7-12]，選擇對甲醇-水和乙腈-水兩種流動相體系及比例進行了考察，發現甲醇-水(25∶75)和乙腈-水(11∶89)條件下，供試品中葛根素的出峰時間和分離效果都很好，均可滿足檢測要求。考慮溶劑的毒性與檢測成本，本研究選擇了甲醇-水(25∶75)為流動相。

3.2.4 檢測波長的選擇 葛根素為異黃酮類衍生物，有紫外吸收，可用HPLC-UV測定。以甲醇-水(25∶75)為流動相，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液5 μL進樣，記錄色譜圖。葛根素對照品和供試品中葛根素色譜峰的二極管陣列檢測器紫外吸收光譜圖如圖5所示。由圖可知，葛根素的最大吸收波長為249 nm，參照現行版藥典中相關葛根素含量測定方法，選擇250 nm為測定波長。通過峰純度分析，在250 nm波長下供試品溶液色譜圖中葛根素色譜峰的峰純度指數為1.00000，因此該波長作為檢測波長，能滿足含量測定的要求。

鐵必康膠囊由9味藥材制成，然而原標準中檢驗項目極為簡單，項目設置非常不完善，無法真實客觀評價鐵必康膠囊產品的質量狀況，更加無法有效地控制產品質量。本研究從質量標準的角度對鐵必康膠囊的薄層色譜鑒別和含量測定方法進行了較為系統的研究，進一步完善了該制劑的質量評價方法，可更加科學、有效地評價該制劑的內在質量，保障臨床用藥的有效性。