三七各部位氫氧同位素特征及其與灌溉水關系

李昕悅，梁社往，李冬雪，郭 婷，趙會玉，郭春平，何忠俊

(1.云南農業大學 資源與環境學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201； 3.曲靖市土壤肥料工作站，云南 曲靖 655000；4.玉溪市農田建設與土壤肥料工作站，云南 玉溪 653100)

穩定氫氧同位素技術具有示蹤、整合和指示等多項功能，在大氣科學、地球化學、植物水循環[1]等方面發揮著巨大優勢。在自然界中，生物體內的H、O等同位素組成受生物代謝類型、環境、氣候等因素的影響而發生自然分餾效應，從而使不同來源的物質中同位素自然豐度存在差異[2]。這些差異不易受加工條件以及人為因素改變，利用生物體中同位素差異，能夠區分其產地[3-4]。近年來，穩定同位素分析技術已在食品產地溯源中成功運用，在牛肉[5]、羊肉[6]、葡萄酒[7]、茶葉[8]、青稞[9]等的產地和真偽鑒別起到了較大作用。對人指甲、頭發[10]中穩定氫氧同位素的研究表明，不同城市常住居民頭發、指甲與其飲用水中δD、δ18O比率具有顯著相關性。王慧文等[11]分析了雞肉、飼料、和水中的δD，發現雞肉δD與飲水中的δD呈高度正相關。

三七(Panaxnotoginseng)為五加科人參屬植物[12]。以塊根、蘆頭用藥，味甘、微苦、性溫。主治出血癥，跌打損傷，瘀血腫痛。對于腦血管病、心血管病、血栓、血瘀有較好的功效。還具有消腫定痛，改善心肺血液循環、以及提高人體免疫力、改善淋巴循環的功能。蘆頭在三七地下部分中所占比例小，皂苷含量高，主要用于制藥企業提取皂苷組分的原料[14-15]。三七在云藥產業中占有及其重要的地位，2015年我國三七種植面積達70萬畝，產量超過3.5萬噸，種植業產值突破120億元，全國以三七為主的系列產品產值超過500億元。“文山三七”第一批通過GAP(國家食品藥品監督管理局組織制定和實施的行業管理法規)基地認證，第一個獲得國家地理標志成品保護中藥材[16]，2016年《文山三七道地藥材》行業標準發布實施。2016年云南省批準三七莖葉作為地方特色食品[16]，筋條和須根主要用于藥膳[14]。因此，三七各部位產地鑒別均具有重要意義。

三七主產于云南文山州各縣，近年來，隨著三七連作障礙加重、道地產區租地成本增加和三七需求量的增長，推動了三七價格上漲，三七種植區域已由文山州向周邊州市大面積擴展，另外，云南周邊的廣西白色、貴州興義、四川西昌等地也有種植。市場上充斥著真假難辨的三七。產地是道地藥材形成的一個重要原因[14]，由于道地藥材盲目引種導致的質量下降，生產及銷售等環節可能存在偽劣藥材，增加了中藥材安全事故發生的風險。目前中藥材產地的判別方法主要依靠形態、理化鑒別及指紋圖譜、二維碼等技術，其精確度較低，說服力不足[17]。何忠俊等[17-18]發現三七塊根δ18O主要受1月平均溫、7月最高溫、1月最低溫、緯度、濕度、年均溫、年降水量的影響；塊根δ13C受產地的1月最低溫、7月平均溫、年均溫、經度的綜合影響。但關于三七各部位穩定氫氧同位素特征、相關性及其與灌溉水的關系研究甚少。因此，本研究對三七各部位穩定氫氧同位素特征及其影響因素進行研究，擬為三七產地溯源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 三七主產區采樣調查

采集三七產區三年生春三七整株及灌溉水樣品。控制種源一致(即文山種源)，分別采自廣西靖西片區4點，云南文山片區15點、云南新拓展片區24點(紅河、昆明、曲靖、玉溪、騰沖)。三個片區采樣點數根據種植面積確定，廣西靖西片區由于三七種植面積小，故采樣點小于其余兩個片區；云南新拓展片區覆蓋5個州市，種植面積大于文山片區，故采樣點最多。采樣地基本情況列于表1。

表1 采樣地基本情況Table 1 Basic situation of sampling site

利用隨機多點取樣法進行采集，每個樣點按地塊東、南、西、北、中隨機采集三七植株15株。現場測定經緯度、海拔等地理信息。將活體樣本帶回實驗室，用滴加少許洗潔精的自來水洗去泥土，然后用2%的檸檬酸蒸餾水洗去附著的礦質元素，最后用蒸餾水反復沖洗干凈。涼去附著的水分，將莖葉、蘆頭、塊根、筋條、須根分開，稱鮮重。105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒重，稱干重、粉碎過100目篩，備用。

采集樣點附近灌溉水約500 mL密封，于4 ℃條件保存備用。

1.2 穩定氫、氧同位素測定

三七各部位及灌溉水穩定氫、氧同位素在中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所穩定同位素實驗室進行。

1.2.1三七(各部位)穩定氫、氧同位素測定 稱取一定量樣品(0.5 mg)放入元素分析儀 (PYRO-cube,德國Elementar 公司)樣品盤中，經燃燒爐高溫裂解后，樣品中的氫元素和氧元素轉化為純凈的H2和CO氣體后，進入氣體同位素質譜儀(Isoprime 100，德國Elementar公司)進行檢測。元素分析主要條件：裂解管主要填料為碳玻璃，燃燒爐溫度為1 450 ℃，高純氦氣(He，99.999%)作為載氣。同位素質譜主要條件：氦氣流量為125 mL·min-1，CO阱電流200 μA，H2阱電流400 μA。采用稀釋器對CO氣體進行稀釋，實現兩種氣體的同時測定。以USGS54、USGS55和USGS56作為標準樣對樣品進行校正。

穩定氫同位素比率用δD表示，即δ2H，相對標準為V-SMOW(標準平均海洋水)。計算公式為:

δD‰= (R樣品/R標準-1) ×1 000

(1)

式中：R=2H/1H[18]。其中R樣品為被測樣品的同位素比值，R標準為標準品的同位素比值，下同。

1.2.2灌溉水穩定氫、氧同位素測定 用注射器吸取水樣2 mL，經直徑13 mm、孔徑0.45 μL的尼龍66針筒式過濾器過濾后加入微量瓶中，進入元素分析儀，經1 450 ℃高溫裂解成H2，進入同位素質譜儀進行檢測，控制氦氣流量為125 mL·min-1。分析過程中每12個樣品穿插一個國際標樣IAEACH-7(δDV-SMOW=(-100.3±2)‰)。

穩定氧同位素比率用δ18O表示，δ18O的標準物質為SMOW (標準平均海洋水)。計算公式為:

δ18O‰=(R樣品/R標準-1)×1 000

(2)

式中：R=18O/16O[19]。

1.3 數據處理

采用Excle 2010軟件進行數據處理，采用SPSS 19.0進行Duncan’s法多重比較分析、相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同產地三七各部位δD、δ18O差異

三個片區三七各部位δD差異列于表2。經Duncan’s法多重比較，三個產區中三七莖葉、筋條、須根δD無顯著差異；蘆頭和塊根中δD以廣西靖西片區顯著高于云南文山片區和云南新拓展片區，而云南文山片區和云南新拓展片區差異不顯著。各部位δD值具有顯著性差異，總體趨勢為蘆頭、塊根、筋條顯著高于莖葉和須根。

表2 不同產地間三七各部位δD組成差異分析Table 2 Analysis of the difference in the δD composition of each organ of Panax notoginseng among different producing areas

三個片區三七各部位δ18O差異列于表3。三七莖葉、蘆頭、塊筋條、須根中δ18O均無顯著差異；而塊根δ18O則以云南新拓展片區顯著高于廣西靖西片區，云南文山片區與廣西靖西片區、云南新拓展片區無顯著差異。三個片區各部位δ18O值中，廣西靖西片區以塊根顯著高于蘆頭和須根，與莖葉、筋條差異不顯著；云南文山片區以塊根顯著高于蘆頭、莖葉和須根，而與筋條差異不顯著，莖葉、蘆頭顯著高于須根；云南新拓展片區中莖葉、蘆頭、塊根、筋條之間無顯著差異，但顯著高于須根。各部位間δ18O值大小順序為塊根>筋條>莖葉>蘆頭>須根。

表3 不同產地間三七各部位δ18O組成差異分析Table 3 Difference analysis of δ18O composition of various organs of Panax notoginseng among different producing areas

2.2 三七各部位中穩定氫氧同位素間及其與地理信息的相關性

三七各部位中穩定氫同位素間的相關性分析列于表4。由表4可知，莖葉δD與蘆頭、須根δD呈顯著正相關；蘆頭δD與塊根、筋條、須根δD呈極顯著的正相關，與莖葉δD呈顯著正相關；須根δD與莖葉、筋條δD呈顯著相關，與蘆頭δD呈極顯著的正相關。總體上，僅蘆頭δD與其余各部位δD均達到極顯著和顯著的正相關。莖葉δD與經度呈極顯著的負相關、與緯度呈極顯著的正相關；蘆頭δD與海拔呈極顯著的負相關，筋條δD與經度呈顯著的正相關。須根、筋條由于樣本不足，僅有21組數據進行相關性分析，所以筋條與經度的相關系數絕對值大于莖葉與經度的相關系數卻未達到極顯著相關。

表4 三七各部位中穩定氫同位素間的相關性分析Table 4 Correlation analysis of stable hydrogen isotope in various organs of Panax notoginseng

三七各部位中穩定氧同位素間的相關性分析列于表5。由表5結果可知，除塊根δ18O與筋條、須根δ18O相關性不顯著外，三七各部位間δ18O均呈極顯著正相關。三七各部位δ18O與經度呈極顯著的負相關，與緯度呈極顯著的正相關，與海拔呈顯著正相關。

表5 三七各部位中穩定氧同位素間的相關性分析Table 5 Correlation analysis of stable oxygen isotope in various organs of Panax notoginseng

2.3 灌溉水氫氧同位素與經緯度、海拔及三七各部位δD、δ18O關系

不同三七產區灌溉水穩定同位素組成差異列于表6。經Duncan’s法多重比較，灌溉水δD、δ18O變化規律基本相同，以廣西靖西片區灌溉水中δD、δ18O顯著高于云南文山片區和云南新拓展片區，云南文山片區與云南新拓展片區差異不顯著。灌溉水中δD、δ18O之間呈顯著正相關關系(r=0.958，P<0.01)。

表6 不同產地間灌溉水同位素組成差異分析Table 6 Analysis of the difference in isotope composition of irrigation water between different producing areas

對灌溉水δD、δ18O與經緯度、海拔相關性研究，結果列于表7。表7結果表明，灌溉水δD、δ18O與經度呈顯著的正相關，與緯度呈顯著的負相關，與海拔呈極顯著的負相關。對灌溉水與各部位氫氧同位素進行相關性分析發現，僅蘆頭中δD與灌溉水中δD呈顯著正相關關系。而其余部位δD、δ18O與灌溉水中δD、δ18O均無顯著相關。

表7 灌溉水中δD、δ18O與經緯度、 海拔及三七各部位δD、δ18O相關性分析Table 7 Correlation analysis of δD and δ18O in irrigation water with latitude and longitude altitude and δD and δ18O of various organs of Panax notoginseng

3 討論

三七分布區地理、氣候、土壤、地質背景差異明顯。根據本課題組前期研究，目前三七分布區地理范圍經度在98.501°～106.470°，緯度在22.942°～25.677°之間，海拔在490～2 319 m，年均溫12.9～19.9 ℃、年降水932～1 664 mm、≥10 ℃積溫3 125.3～6 688 ℃(根據經緯度和海拔由TCMGIS-1計算得出)，跨越南亞熱帶、中亞熱帶、北亞熱帶、南溫帶、中溫帶五個熱量帶，濕潤和半濕潤2個水分區[17-19]。三七種植區具有地域范圍相對較小，但海拔、氣候類型、地質背景、土壤類型差異大的特征。

三個三七產區中莖葉、筋條、須根δD、δ18O無顯著差異；蘆頭和塊根中δD以廣西靖西片區顯著高于云南文山片區和云南新拓展片區，而云南文山片區和云南新拓展片區差異不顯著。符合隨海拔、緯度增加而降低的規律[20]。而δ18O的變化規律則與δD相反，有隨緯度、海拔增加而增加的趨勢。以云南新拓展片區顯著高于廣西靖西片區，云南文山片區與廣西靖西片區、云南新拓展片區無顯著差異。各部位δD、δ18O值具有顯著差異，δD總體趨勢為蘆頭、塊根、筋條顯著高于莖葉和須根，δ18O值大小順序為：塊根>筋條>莖葉>蘆頭>須根。由于纖維素合成過程中氧同位素高度富集，使三七主根δ18O由地表水δ18O的負值變為正值[17]，致使其與δD規律相反，掩蓋了地表水δ18O的地域性規律。本課題組前期研究表明，三七塊根內氧同位素主要受產地溫度狀況、緯度、濕度、年降水的影響，具有顯著的地域特征[17]。

部位間δD、δ18O相關性研究表明，塊根δD、δ18O與筋條、須根δD、δ18O相關性均不顯著。蘆頭δD與其余各部位δD均達極顯著和顯著正相關。莖葉δD與經度呈極顯著的負相關、與緯度呈極顯著的正相關，蘆頭δD與海拔呈極顯著的負相關，筋條δD與經度呈顯著正相關。三七各部位間δ18O均呈極顯著正相關。三七各部位δ18O與經度呈極顯著的負相關，與緯度呈極顯著的正相關，與海拔呈顯著正相關。總體上看，除塊根與筋條、須根外，三七各部位間δ18O及其與經緯度的相關性均呈極顯著相關，與海拔呈顯著相關。說明三七各部位δ18O地域特征明顯，可以相互預測，均可作為產地溯源指標。而三七各部位δD能否作為溯源指標值得做進一步的探討。

三七產區地表水具有明顯的經度、緯度和高程效應[21]。地表水δD、δ18O與經度呈顯著的正相關，與緯度呈顯著的負相關，與海拔呈極顯著的負相關。灌溉水中δD、δ18O之間呈極顯著正相關關系。但僅蘆頭中δD與灌溉水中δD呈顯著正相關關系。而其余部位δD、δ18O與灌溉水中δD、δ18O均無顯著相關。孫淑敏等[6]通過對羊肉樣品和當地羊飲水中δD進行分析，發現羊肉中δD與飲用水δD呈極顯著正相關；郭波莉等[22]發現不同牧區牦牛肉中δD與飲水密切相關，且均有隨海拔升高而降低的趨勢。由于三七不同部位化學成分、生理生化特征等的不同，加之三七次生代謝產物占有很高的比例，與動物和以初生代謝產物為主的植物對灌溉水δD、δ18O分餾、富集規律可能有所不同，導致不同部位δD、δ18O與灌溉水δD、δ18O關系發生改變。

4 結論

利用元素分析儀-同位素比率質譜儀測定了不同產區春三七各部位及灌溉水氫氧同位素比率，并結合Duncan’s多重比較和相關分析研究了三七各部位氫氧同位素特征及其與經緯度、海拔和灌溉水氫氧同位素的關系。結果表明，三七各部位δD符合隨海拔、緯度增加而降低的規律，而δ18O的變化規律則與δD相反。三七各部位δD、δ18O值具有顯著差異，變化規律各異。三七各部位δ18O地域特征明顯，除塊根與筋條、須根之間外，其余部位間可以相互預測，均可作為產地溯源指標。三七產區灌溉水中δD、δ18O之間呈極顯著正相關，具有明顯的經度、緯度和高程效應，但僅蘆頭δD與灌溉水δD呈顯著正相關。