針刀療法對肩周炎模型兔肩關節囊局部組織中基因蛋白表達的影響

張照慶，王小飛，尹 晶，武 歡，金 瑋

(武漢市第三醫院，湖北 武漢 430001)

肩關節周圍炎,簡稱肩周炎,是肩關節周圍肌肉、肌腱、韌帶和關節囊等軟組織的慢性無菌性炎癥性疾病,據流行病學調查,該病在我國人群中的發病率高達5%,多發于40歲以上的中老年人,女性多于男性[1]。目前認為盂肱關節增厚、局部滑膜組織炎癥狀態和疼痛遞質的釋放是引起肩周炎疼痛及活動受限的主要原因[2]。近年來，研究表明，肩周炎患者肩關節內炎癥介質(IL-6)的上調在其疼痛產生機制中起著重要作用[3]，同時，研究發現特定內源性蛋白因子(HMGB1)與肩關節疼痛有密切相關性[4]，ASIC是一類由細胞外酸化所激活的陽離子通道，ASIC3為其中一個亞基蛋白，與關節炎性疼痛密切相關[5]；中醫針刀療法作為一種治療肩周炎的有效方法，文獻研究證實，在改善肩關節功能活動、減少肩關節疼痛介質和降低炎性因子水平具有顯著作用[6-8]。

本研究建立在針刀可改善肩周炎引起的肩關節疼痛和活動受限有效性基礎上，觀察針刀治療肩周炎關節囊滑膜組織形態學變化，檢測肩關節滑膜內炎性因子6(IL-6)和內源性蛋白因子(HLGB1)及酸離子通道蛋白(ASIC3)的蛋白和基因表達，探討針刀治療肩周炎的療效和可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物 健康新西蘭雄性大白兔30只，6月齡，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供，許可證號SCXK(鄂)2016-0011，體重(2.5±0.5)kg，飼養環境：武漢市第三醫院動物實驗室，室溫20～24 ℃,濕度40%～60%，保持實驗環境舒適、安靜衛生。

1.2 動物分組和模型制備 采用隨機數字表法分為三組，空白組、模型組、針刀組，每組各10只；實驗過程嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》(中華人民共和國科技部頒發)[9]。所有動物適應性飼養7 d，1籠1只，單獨喂養，健康飲食、攝水；空白組正常飼養，不做治療；模型組造模后正常飼養，不做治療。

1.3 針刀干預方法 造模成功后，固定模型兔于兔臺，觸診患肢肩關節，常規碘伏消毒，定位喙突外緣、岡上肌腱大結節處、結節間溝，采用漢章1型4號針刀與皮膚垂直方向快速刺入，刀口與主要神經血管、肌肉走向平行，行縱豎橫剝2～3刀，術畢，迅速用無菌紗布按壓創口1 min，于造模成功后第2天、第8天、第15天、第22天各治療1次，共4次，不予其他處理。

1.4 實驗儀器與試劑 ZD-9556多功能水平搖床、10%水合氯醛(武漢卡引生物技術有限公司)、K3型低溫高速離心機(美國Thermo公司)、DYCP-31A型電泳儀、DY-Ⅲ型電泳槽 (美國伯樂);凝膠成像系統Image Quant LAS 4000型 (德國GE公司)，FS/FASS030石蠟切片機(德國LETIZ產)、光學顯微鏡(日本OLYMPUS株式會社)、臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、冷凍離心機(湖南湘儀儀器)、實時熒光定量PCR儀(美國Life technologies公司)、Western blot試劑盒。

1.5 實驗方法

1.5.1 模型制作：造模采用機械加冰敷造模法[10-12]：將兔右肩部外側脫毛,面積為6 cm×6 cm，俯臥位固定,后肢和左前肢與兔臺固定，將模型兔患肢遠端與IVHE-0電動振蕩器(國營東臺糧油機械廠生產)固定連接，以240次/min頻率，l.5 cm振幅平行搖動右肩關節，6 h/d，搖動過程前后密切觀察模型兔情況，防止右前肢脫離振蕩器，預防受傷，機械勞損后的模型兔固定于兔臺，每天即刻將塑料內裝冰塊外敷大鼠左肩部6 h/d，機械加冰敷持續3 d，冰塊融化后及時更換。3 d后觀察兔右前肢形態變化，若呈“外翻”狀態，運動受限，主動爬行時身體傾斜，出現關節活動不利、疼痛反應增強，并且局部軟組織均輕度腫脹，肉眼可見不同程度充血或瘀斑時，提示肩周炎模型兔造模成功[13]。

1.5.2 干預方法：空白組給予正常飼養,不做治療；模型組：造模后正常飼養，不做治療。針刀組：固定模型兔于兔臺，觸診患肢肩關節，常規碘伏消毒，定位喙突外緣、岡上肌腱大結節處、結節間溝，采用漢章1型4號針刀與皮膚垂直方向快速刺入，刀口與神經血管、肌肉走向平行，以松為度，于造模成功后第2天、第8天、第15天、第22天各治療1次，共4次。

1.5.3 標本采集：用空氣栓塞法處死實驗兔后迅速剝取右側肩關節內滑膜，取下關節滑膜囊及周圍組織，在冰面上用0.9%氯化鈉溶液漂洗干凈，取大小均約2 cm×2 cm×0.3 cm關節滑膜囊，于20%多聚甲醛溶液中固定1周，用于病理組織切片HE染色；取大小均約1 cm×1 cm關節滑膜囊及周圍組織，液氮速凍24 h后，轉移至-80 ℃冰箱保存，用于RT-PCR和Western blot檢測。

1.6 檢測指標

1.6.1 HE染色：將新鮮取材局部樣本組織，用4%多聚甲醛固定1周，取出后將目的部位組織修剪平整，經過脫水機內依次梯度酒精脫水、包埋、切片、蘇木伊紅染色以及脫水封片步驟后，采用光學顯微鏡觀察各組局部滑膜肌組織病理形態。

1.6.2 蛋白免疫印跡法(Western blot)：細胞裂解法提取肩關節囊組織塊總蛋白；BCA法測定蛋白濃度，Larry法測蛋白濃度，取40 μg蛋白，在蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃沸水浴5 min。配制分離膠、濃縮膠，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進行恒壓電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉印，將轉好的膜置于封閉液封閉，37 ℃，1 h，隨后除去封閉液，加入稀釋好的一抗(稀釋比例：IL-6為1∶500，HMGB1和ASIC3為1∶1000)，4 ℃，孵育過夜，回收一抗，用TBST清洗3次，每次5 min，加入稀釋好的二抗(稀釋比例為1∶10000)，室溫下孵育30 min，用TBST于搖床上清洗4次，每次5 min。滴加ECL溶液于膜上，暗室中進行曝光，顯影、定影。以GAPDH為內參測定IL-6、HMGB1和ASIC3蛋白相對表達量。

1.6.3 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)：IL-6、HMGB1、ASIC3mRNA表達水平將兔肩關節局部組織塊從液氮中取出,研磨后將粉末裝入預冷的Ep管中,每管加入1 ml Trizol,用槍吹打數次,室溫放置5 min,獲取總RNA提取物。取3 μl總RNA進行反轉錄以獲取cDNA。PCR反應體系，包含樣本體系1.5 μl及引物體系18.5 μl。取3 μl總RNA進行反轉錄以獲取cDNA。PCR反應體系包含樣本體系1.5 μl及引物體系18.5 μl。用相對定量2-△△CT法分析結果,得到各個樣本目的基因的CT值-各個樣本的看家基因。見表1。

1.7 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析。經檢測數據符合正態分布，以均值±標準差表示，根據數據是否符合方差齊性分別采用單因素方差分析(組間比較采用Tukey檢驗)或非參數秩和檢驗(組間比較采用Dunn’s檢驗)等統計方法。當P<0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肩關節周圍組織肉眼觀察 空白組肩關節形態正常，打開關節腔無積液；模型組肩關節周圍組織充血腫脹明顯，周圍肌肉有組織粘連，打開關節腔時有大量黃色積液流出；針刀組兔肩關節周圍肌肉肥厚和粘連情況較輕，打開關節腔時黃色積液相對較少。

2.2 肩關節周圍組織病理學觀察 空白組：滑膜細胞結構稀疏，毛細血管較少，肌腱纖維排列整齊，無炎癥細胞浸潤；模型組：滑膜上皮層毛細血管增多，序列紊亂，可見纖維素滲出，肌腱外膜上皮細胞增生，肌纖維斷裂，肌間質中纖維素滲出、機化和結締組織增生；針刀組：滑膜細胞排列同正常組，肌腱纖維排列整齊，較模型組損傷部位明顯減輕，炎癥細胞浸潤相對較少，同時模型組病理組織修復情況較針刀組差(圖1)。

圖1 各組大鼠肩關節局部組織情況(HE染色,×200)

2.3 各組肩關節滑膜中IL-6、HMGB1和ASIC3蛋白表達水平比較 見表2(圖2)。空白組、模型組和針刀組間HMGB1、IL-6及ASIC3蛋白表達水平比較，差異具有統計學意義(均P<0.05)；與空白組比較，模型組家兔肩關節滑膜中HMGB1、IL-6和ASIC3蛋白表達水平比較，差異具有統計學意義(均P<0.05)；與模型組比較，針刀組肩關節滑膜中HMGB1、IL-6、ASIC3蛋白表達水平均降低；與空白組相比，針刀組肩關節滑膜中HMGB1、IL-6、ASIC3蛋白表達水平增加，差異具有統計學意義(均P<0.05)。表明針刀療法可以顯著減少肩周炎模型兔IL-6、HMGB1和ASIC3的蛋白表達水平。

圖2 各組肩關節滑膜中IL-6、HMGB1和ASIC3蛋白條帶

2.4 各組肩關節囊中IL-6、HMGB1、ASIC3 mRNA表達水平比較 見表3。空白組、模型組和針刀組間IL-16、HMGB1及ASIC3基因表達水平比較，差異有統計學意義(均P<0.05)；與空白組比較，模型組兔肩關節滑膜中IL-16、HMGB1和ASIC3基因表達水平增加(均P<0.05)；與模型組比較，針刀組肩關節滑膜中IL-6、HMGB1與ASIC3基因表達水平降低(均P<0.05)；與空白組相比，針刀組肩關節滑膜中IL-6、HMGB1和ASIC3基因表達水平顯著增加(均P<0.05)。表明針刀療法可以顯著減少肩周炎模型兔IL-6、HMGB1和ASIC3的基因表達水平。

表2 各組肩關節滑膜中IL-6、HMGB1和ASIC3蛋白相對表達水平比較

表3 各組肩關節囊中IL-6、HMGB1和ASIC3 mRNA相對表達水平比較

3 討 論

肩周炎是以肩關節疼痛和功能受限為主要癥狀的病癥，目前其機制研究集中于炎癥反應和纖維化相關細胞因子[14-15]。中醫認為肩周炎歸類于“痹癥”或“漏肩風”等范疇，其病因病機主要為肝腎虧虛、風寒濕邪侵襲，氣機阻滯不通而致病[16]，造成肩關節廣泛粘連、軟組織瘢痕、攣縮等引起肩關節活動受限和疼痛。針刀療法可對局部軟組織進行松解，可降低自由基、促進炎癥因子吸收、修復局部組織攣縮[17],將生物力學與人體解剖學相結合來發揮治療軟組織疼痛及骨關節病的作用[18]，是中醫“扶正祛邪”和“舒筋止痛”作用的體現。

IL-6作為重要的炎性細胞因子，也是重要的致痛因子，可誘導機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏[19],同時IL-6可以充當中樞敏化介質導致A-δ纖維和C纖維初級傳入神經元變得異常敏感，從而導致外周敏化產生疼痛[20],廣泛參與機體炎癥反應與自身免疫性疾病的發生、發展過程[21]。HMGB1是一種與染色質松散相關的非組蛋白脫氧核糖核酸結合蛋白，可以介導先天免疫反應的激活，包括趨化和細胞因子的釋放,在無菌損傷，缺血性損傷中可誘發典型的炎癥反應[22-23]，HMGB1可以誘導分解代謝的分子，例如基質金屬蛋白酶(MMP)的表達，這些分子負責關節軟骨的分解，持續產生HMGB1及其下游促炎和分解代謝分子，最終會導致軟組織損傷。Thankam等[24]通過對15例肩袖損傷后疼痛患者的局部組織采用組織學、免疫熒光、RT-PCR等檢測技術發現炎癥細胞和HMGB1過表達，并且和肩關節疼痛嚴重程度密切相關，證實了HMGB1是參與了肩關節疼痛的重要影響因子之一。疼痛相關ASIC3，可以引起關節損傷而導致痛覺過敏的產生，廣泛分布于肩關節滑膜中，通過PAR2信號傳導中樞誘導外周敏化，參與痛覺過敏的外周機制，在慢性炎癥性疼痛病理過程中產生重要作用。

本實驗結果表明，針刀療法在治療肩周炎中作用機制可能是通過減少IL-6、HMGB1表達水平和下調ASIC3的釋放來改善肩周炎局部病理變化，可抑制滑膜組織增殖、延緩肩關節囊組織的炎性浸潤,從而有效緩解肩周炎疾病的進一步發展，本實驗因樣本量有限，其具體作用機制有待更進一步探討。