GnRH激動(dòng)劑長(zhǎng)方案和拮抗劑方案中HCG日孕酮與獲卵數(shù)比值對(duì)后續(xù)FET周期妊娠結(jié)局的影響

吳靜，巨瑛，黃劍磊，李博，王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038)

隨著輔助生殖技術(shù)(ART)的發(fā)展，HCG日孕酮(P)水平與體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)助孕結(jié)局的關(guān)系一直備受關(guān)注。多數(shù)研究認(rèn)為，HCG日升高的P水平因改變子宮內(nèi)膜容受性而影響新鮮移植周期的妊娠結(jié)局[1-3]。然而，亦有研究提出提前升高的P水平是“過(guò)早黃素化”的表現(xiàn)，可能影響胚胎發(fā)育[4-5]，該影響是否對(duì)后續(xù)凍融胚胎移植(FET)的妊娠結(jié)局產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，目前尚有爭(zhēng)議[6-7]。既往研究多關(guān)注HCG日P水平對(duì)FET周期整體人群的作用關(guān)系，而對(duì)不同促排卵(COS)方案不同P水平的分層分析較少；且考慮到HCG日P水平具有多卵泡的累積效應(yīng)，與卵巢反應(yīng)有關(guān)[8]。因此，本研究將HCG日P/獲卵數(shù)(O)比值作為妊娠結(jié)局的變量指標(biāo)，回顧性分析促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長(zhǎng)方案及拮抗劑方案中HCG日P/O比值變化對(duì)后續(xù)FET周期妊娠結(jié)局的影響，探索不同COS方案中P/O比值的合適區(qū)間，以期為ART臨床提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

采用回顧性研究，選取2017年10月至2019年12月在空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行FET的患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)取卵次數(shù)≤2次；(2)COS方案為GnRH-a長(zhǎng)方案或拮抗劑方案；(3)胚胎移植次數(shù)≤2次；(4)移植胚胎中至少有1個(gè)優(yōu)質(zhì)或者中等質(zhì)量胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)宮腔粘連或子宮畸形；(2)因各種因素行胚胎種植前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)的周期；(3)雙移植周期；(4)失訪(fǎng)或數(shù)據(jù)缺失。

最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)的2 321個(gè)周期，根據(jù)COS周期HCG日P/O比值不同，將研究對(duì)象分為3組：Ⅰ組，0.02≤P/O≤0.17，764個(gè)周期；Ⅱ組，0.17

二、研究方法

1.COS周期：所有研究對(duì)象均選用IVF或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)助孕，COS方案為GnRH-a長(zhǎng)方案或拮抗劑方案，具體實(shí)施流程參考既往研究[9]。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm或至少3枚卵泡直徑≥17 mm，同時(shí)參考激素水平扳機(jī)，注射重組人絨毛膜促性腺激素(rHCG，艾澤，默克，瑞士)250 μg和/或注射用HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，34～37 h后行經(jīng)陰道B超下穿刺取卵術(shù)。

2.胚胎培養(yǎng)與評(píng)估：根據(jù)病史及取卵取精結(jié)果選擇IVF或ICSI受精，受精后16～18 h查看受精結(jié)果。對(duì)于正常受精的合子繼續(xù)于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)實(shí)驗(yàn)室學(xué)組共識(shí)和Istanbul共識(shí)[10-11]，卵裂期胚胎評(píng)估為3個(gè)級(jí)別：優(yōu)質(zhì)胚胎、中等胚胎、差等胚胎。囊胚評(píng)分采用Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)育為二期以上則判定為囊胚，分為優(yōu)質(zhì)囊胚、中等囊胚和差等囊胚。我中心將優(yōu)質(zhì)卵裂胚/囊胚及中等卵裂胚/囊胚視為可利用胚胎，可利用胚胎均采用玻璃化冷凍技術(shù)保存?zhèn)溆谩?/p>

3.FET：月經(jīng)周期規(guī)律、排卵正常者選用自然周期(NC)，月經(jīng)周期不規(guī)律或排卵障礙者選擇微刺激方案(OI)或激素替代周期(HRT)進(jìn)行子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備。卵裂期胚胎解凍后培養(yǎng)4～5 h移植，囊胚解凍后培養(yǎng)2 h移植。移植術(shù)后第13～15天查血β-HCG，β-HCG>10.0 U/L為HCG陽(yáng)性。HCG陽(yáng)性者在移植術(shù)后28～30 d首次行陰道B超檢查，觀察宮內(nèi)是否可見(jiàn)孕囊，有孕囊者判斷為臨床妊娠，同時(shí)核實(shí)孕囊數(shù)目。隨訪(fǎng)妊娠情況至孕20周以后。

4.收集資料及主要觀察指標(biāo)：收集一般臨床資料包括：女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)、不孕類(lèi)型、不孕年限、不孕因素；COS方案、HCG日激素水平、卵母細(xì)胞成熟度(MⅡ卵數(shù)/獲卵總數(shù))及受精方式等；FET周期移植日子宮內(nèi)膜厚度和形態(tài)、移植胚胎數(shù)及質(zhì)量等。主要觀察指標(biāo)包括：臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù))、持續(xù)妊娠率(持續(xù)妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù))、流產(chǎn)率(流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù))，異位妊娠率(異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù))及著床率(著床數(shù)/移植胚胎數(shù))。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、三組患者臨床基本情況比較

患者一般資料分析顯示：女方年齡、AMH、AFC、COS方案、HCG日E2及P水平、促性腺激素(Gn)總量及獲卵數(shù)3組間有顯著性差異(P<0.05)，BMI、不孕因素、不孕年限、不孕類(lèi)型、精子來(lái)源、卵母細(xì)胞成熟度及受精方式3組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。FET周期中，移植日子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)、移植胚胎數(shù)、移植胚胎類(lèi)型及質(zhì)量3組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 不同P/O比值各組患者一般資料比較[(-±s)，n(%)]

續(xù)表

表2 不同P/O比值各組患者胚胎移植情況比較[(-±s)，n(%)]

二、兩種COS方案中P/O比值對(duì)妊娠結(jié)局影響的對(duì)比分析

單因素分析結(jié)果顯示：拮抗劑方案中不同P/O比值的Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組間，F(xiàn)ET周期的著床率、臨床妊娠率及持續(xù)妊娠率均呈下降趨勢(shì)，且每?jī)山M間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而在GnRH-a長(zhǎng)方案患者中3組間妊娠結(jié)局無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同P/O比值各組FET周期妊娠結(jié)局比較[(-±s)，n(%)]

多元回歸模型矯正基線(xiàn)資料后，不論長(zhǎng)方案還是拮抗劑方案，隨著P/O比值升高，后續(xù)FET周期妊娠結(jié)局均未見(jiàn)顯著變化(P>0.05)(表4)。

表4 多元回歸模型矯正基線(xiàn)資料后不同COS方案不同P/O比值對(duì)FET妊娠結(jié)局的影響分析

三、兩種COS方案中不同P/O亞組對(duì)妊娠結(jié)局影響的交互作用分析

將兩種COS方案中不同P/O亞組間的妊娠結(jié)局行分層分析及交互作用檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：在P/O Ⅰ組和Ⅱ組中，不論長(zhǎng)方案或拮抗劑方案，隨著P/O比值升高，妊娠結(jié)局均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1，圖2)。在拮抗劑方案的Ⅲ組中，隨著P/O比值升高，臨床妊娠率呈顯著下降趨勢(shì)[OR=0.61，95%CI(0.01，0.89)，交互P值=0.026]，而流產(chǎn)率、異位妊娠率及持續(xù)妊娠率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

GnRH-a為長(zhǎng)方案；GnRH-ant為拮抗劑方案；Interaction P-value為交互作用檢驗(yàn)的P值圖1 Ⅰ組中兩種COS方案不同P/O比值變化對(duì)FET周期妊娠結(jié)局影響的分析

GnRH-a為長(zhǎng)方案；GnRH-ant為拮抗劑方案；Interaction P-value為交互作用檢驗(yàn)的P值圖2 Ⅱ組中兩種COS方案不同P/O比值變化對(duì)FET周期妊娠結(jié)局影響的分析

GnRH-a為長(zhǎng)方案；GnRH-ant為拮抗劑方案；Interaction P-value為交互作用檢驗(yàn)的P值圖3 Ⅲ組中兩種COS方案不同P/O比值變化對(duì)FET周期妊娠結(jié)局影響的分析

討 論

在COS過(guò)程中，外源性FSH可誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞上黃體生成素受體(LHR)的表達(dá)，特別在卵泡晚期，超生理水平的FSH和E2協(xié)同作用致LHR大量表達(dá)，顆粒細(xì)胞對(duì)LH或LH類(lèi)似物更加敏感。即使GnRH-a或拮抗劑控制內(nèi)源性L(fǎng)H處于低水平，但與大量LHR結(jié)合仍會(huì)導(dǎo)致P水平的升高[13]。目前認(rèn)為，HCG日異常升高的P水平通過(guò)改變子宮內(nèi)膜種植窗口期基因譜的異常表達(dá)而降低內(nèi)膜容受性，進(jìn)而影響新鮮周期胚胎移植的妊娠結(jié)局[2-3，14]。

另有研究表明，HCG日升高的P水平對(duì)胚胎發(fā)育亦有負(fù)面作用，特別當(dāng)HCG日P≥4.0 noml/L時(shí)，可明顯影響卵子及胚胎質(zhì)量[15]。2019年馬媛等[16]對(duì)6 414個(gè)周期進(jìn)行回顧性分析證實(shí)，HCG日P水平的升高會(huì)降低可利用胚胎率。這種對(duì)胚胎的負(fù)面影響是否會(huì)持續(xù)到后續(xù)的FET周期，目前研究較少。一項(xiàng)囊括了7 229個(gè)周期的研究發(fā)現(xiàn)FET周期的妊娠結(jié)局不受提前升高的HCG日P水平的影響[6]。而另一項(xiàng)納入3 400個(gè)周期的回顧性分析結(jié)果顯示，HCG日高P水平降低了可用胚胎率，因此降低了后續(xù)周期的累積活產(chǎn)率[7]。

由于不同的作用原理，上述差別在不同的COS方案中是否一致尚不清楚。目前臨床較常用的COS方案是GnRH-a長(zhǎng)方案及拮抗劑方案。Santos-Ribeiro等[17]研究顯示，拮抗劑方案患者當(dāng)HCG日P≤1.56 nmol/L或>4.68 nmol/L時(shí)活產(chǎn)率明顯降低。Orvieto等[18]認(rèn)為長(zhǎng)方案HCG日P升高的發(fā)生率較拮抗劑方案高。此外，考慮HCG日P水平與卵巢反應(yīng)、多個(gè)卵泡的累積效應(yīng)有關(guān)[19]，因此研究升高的P水平對(duì)卵子和胚胎質(zhì)量及后續(xù)FET周期的影響，應(yīng)以HCG日P水平/獲卵數(shù)的比值，即每個(gè)卵子對(duì)應(yīng)的P水平為自變量指標(biāo)更準(zhǔn)確[20-21]。目前探討P/O比值與FET周期妊娠結(jié)局關(guān)系的報(bào)道甚少，可參考的分組依據(jù)亦較少。有文獻(xiàn)認(rèn)為P/O比值對(duì)妊娠結(jié)局影響的cut-off值為0.38[22]，還有研究將分組切點(diǎn)定為0.34[23]。本研究將Ⅱ組與Ⅲ組間的分組切點(diǎn)定為0.34，與文獻(xiàn)中類(lèi)似。為探索更精確的P/O比值區(qū)間，又將<0.34的研究對(duì)象分為兩組，因此本研究中將研究對(duì)象一共分為3組，切點(diǎn)分別為0.17及0.34。

單因素統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：隨著P/O比值增高，拮抗劑方案組FET周期著床率、臨床妊娠率及持續(xù)妊娠率均處于下降趨勢(shì)。然而矯正基線(xiàn)數(shù)據(jù)后，不論長(zhǎng)方案或拮抗劑方案，其后續(xù)FET周期妊娠結(jié)局均不受P/O比值變化的影響，與目前多數(shù)研究[6，16]結(jié)論一致。本研究進(jìn)一步對(duì)兩種COS方案的不同P/O比值亞組間進(jìn)行細(xì)化的分層分析，發(fā)現(xiàn)在P/O高值組，拮抗劑方案組中隨著HCG日P/O比值升高，后續(xù)FET周期臨床妊娠率呈下降趨勢(shì)，而長(zhǎng)方案組不受影響。既往此類(lèi)研究多以整體人群為研究對(duì)象，未進(jìn)行不同COS方案的不同P/O比值組間的分層分析。而分層分析后長(zhǎng)方案與拮抗劑方案妊娠結(jié)局的不同，考慮可能與兩種方案不同的作用機(jī)理相關(guān)。

GnRH-a長(zhǎng)方案在使用外源性Gn前經(jīng)過(guò)了垂體降調(diào)節(jié)，即連續(xù)小劑量的GnRH-a與垂體GnRH受體結(jié)合使受體消耗，最終垂體脫敏抑制內(nèi)源性Gn的分泌，使體內(nèi)LH保持相對(duì)穩(wěn)定的低水平，較好地抑制早發(fā)型LH峰的發(fā)生，降低卵泡黃素化發(fā)生率。GnRH拮抗劑通過(guò)與內(nèi)源性GnRH競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體，迅速減少垂體Gn分泌，而這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合是可逆的，去除用藥后48 h即可解除對(duì)垂體的抑制。該方案擺脫了恢復(fù)周期較長(zhǎng)的降調(diào)節(jié)作用，對(duì)垂體抑制較小，故LH水平略高或早發(fā)型LH峰發(fā)生率較高[24]。高的LH水平與晚卵泡期卵泡上大量表達(dá)的LHR相結(jié)合致使P水平上升，因此卵泡黃素化發(fā)生率增加，潛在的卵子質(zhì)量及胚胎質(zhì)量下降，可能導(dǎo)致拮抗劑方案后續(xù)FET周期臨床妊娠率下降。

2017年一項(xiàng)體外試驗(yàn)研究表明，F(xiàn)SH可刺激體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞中3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(3β-HSD)的表達(dá)并增加其酶促活性，從而將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為P，促進(jìn)顆粒細(xì)胞中P的合成和輸出[25]。相較于拮抗劑方案，GnRH-a長(zhǎng)方案對(duì)垂體抑制較深，Gn用量多[26]。因此，長(zhǎng)方案中高劑量的Gn刺激卵巢，促使生成P的酶表達(dá)及活性進(jìn)一步增加，導(dǎo)致高水平P累積，滲漏到體循環(huán)中使血清P水平升高，而非卵泡黃素化。故同樣的P/O高值組，兩種方案每卵泡對(duì)應(yīng)的P水平上升原理不同可能是導(dǎo)致后續(xù)FET周期妊娠結(jié)局不同的重要原因。

2017年Cochrane數(shù)據(jù)庫(kù)中的meta分析結(jié)論提示：不同子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對(duì)種植率、臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率的影響幾無(wú)差別[27]，因此本研究在設(shè)計(jì)時(shí)未考慮子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對(duì)妊娠結(jié)局的影響。2020年Gerber等[28]對(duì)17 830個(gè)周期統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果顯示：Gn總量過(guò)高可能通過(guò)改變子宮內(nèi)膜容受性而降低新鮮周期移植的活產(chǎn)率，而FET周期的妊娠結(jié)局無(wú)明顯變化，此結(jié)論與既往研究[29]一致，同時(shí)該文獻(xiàn)中回歸分析的結(jié)果顯示：不論新鮮移植周期還是FET周期，妊娠結(jié)局均不受Gn刺激時(shí)長(zhǎng)的影響。因此，本文亦未將Gn天數(shù)納入統(tǒng)計(jì)分析。

綜上所述，應(yīng)用GnRH-a長(zhǎng)方案促排卵后續(xù)FET周期妊娠結(jié)局不受HCG日P/O比值影響；而拮抗劑方案中，在P/O高值組，隨著其比值升高，后續(xù)FET周期臨床妊娠率有下降趨勢(shì)。因此，應(yīng)用拮抗劑方案促排卵應(yīng)密切關(guān)注HCG日P水平。若既往出現(xiàn)HCG日P升高史，再次COS可首選GnRH-a長(zhǎng)方案，以獲得較優(yōu)的妊娠結(jié)局。但本研究仍有一定局限性，尚需多中心、前瞻性的研究對(duì)后期活產(chǎn)率及妊娠期并發(fā)癥行全面的統(tǒng)計(jì)分析以進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論。