氫嗎啡酮對炎性痛大鼠脊髓ERK1/2信號通路的影響*

石曉玲 賈 偉

(湖北省黃石市中心醫院普愛院區麻醉科，黃石 435001)

炎性疼痛是一種慢性病理性疼痛，可能通過外傷、手術、腫瘤等引起局部組織炎癥損傷，造成病理性疼痛[1]。細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein，ERK)，包括ERK1和ERK2，統稱為ERK1/2，是MAPKs家族主要成員之一，參與細胞編碼相關基因和細胞信號轉導，在神經系統中的激活與各種疼痛的誘發以及維持都密切相關[2-3]。有研究發現，甲醛注射后脊髓組織神經元中ERK1/2磷酸化水平升高，減少ERK1/2磷酸化水平可對甲醛誘導的炎癥性疼痛起一定的抑制作用[4]。氫嗎啡酮(hydromorphine，HM)是一種半合成的阿片受體激動藥，具有起效快、鎮痛作用強、不良反應少等特點[5]。本研究探討炎性痛大鼠脊髓ERK1/2信號通路的變化及HM的鎮痛作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級雄性大鼠30只，8～12周齡，體質量180～240 g，購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0002。

1.1.2主要試劑：HM(宜昌人福藥業有限責任公司)；von Frey纖維毛(IITC)；弗氏完全佐劑(CFA)(Sigma)；DAB顯色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；TRIzol(Invitrogen)；ERK1/2、GAPDH普通PCR上下游引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；抗ERK1/2、p-ERK1/2抗體、山羊抗兔二抗(LI-COR)；TNF-α、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 建立動物模型及分組

將SPF級雄性大鼠30只，隨機分為3組，正常組、模型組和HM組。取20只大鼠，將大鼠麻醉后固定，于右側足底皮下注射CFA(0.1 mL/只)，建立炎性痛大鼠模型。正常組將大鼠麻醉后，于右側足底皮下注射等量生理鹽水。模型組大鼠注射足出現縮足、紅腫、舔爪等自發痛行為表示建模成功。模型建立后隨機分為兩組，HM組：在造模1 d后，腹腔注射0.3 μmol/L HM；模型組：注射等量的生理鹽水，連續注射7 d。

1.3 觀察指標

1.3.1各組大鼠熱痛閾和機械痛閾測定：根據參考文獻[6]，熱痛閾測定：測定大鼠足底部的熱痛反應潛伏期，以此表示熱痛閾。機械痛閾測定：采用不同標號的von Frey纖維毛測定大鼠反應閾值，von Frey纖維毛垂直刺激后爪足底部，彎曲至近似90°持續5 s。躲避反應包括大鼠后足抬起、延遲放落、抖動及舔食后足或逃避，均被認為陽性。

1.3.2血清及脊髓取材：在注射0.3 μmol/L HM后對全部大鼠進行取材，1%戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈取血，4 000 r/min 離心15 min，取上層血清。取血后暴露心臟，插管灌流固定，先以0.9%氯化鈉溶液灌流，再以4%多聚甲醛灌流至四肢僵硬，暴露脊髓后，取出L4～L6損傷側組織。

1.3.3各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量：ELISA試劑盒方法測定各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量。

1.3.4Western blot檢測各組大鼠脊髓中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平：取脊髓組織加入RIPA裂解液裂解后提取總蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉 1 h，TBST洗膜后加入一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h后，使用ECL化學發光法檢測，于暗室成像拍照，以β-actin為內參，使用Image J分析軟件計算各組大鼠中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白相對表達水平。

1.3.5qRT-PCR法檢測各組大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達水平：TRIzol法提取脊髓總RNA，酶標儀檢測其濃度后將總RNA逆轉錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測各組大鼠脊髓中ERK1/2基因的表達水平。引物設計如下：ERK1/2上游5′-CTCAAGCCTTCCAACCTC-3′，下游5′-TTCCACGGCA CCTTATTT-3′；GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGG TGTCAACGGATT-3′，下游5′-GATGCCAAAGTTGTC ATGGATGACC-3’。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，最后72 ℃延伸10 min。每組ERK1/2基因的相對表達量按公式(2-△△Ct法)計算，每個樣本重復檢測3次。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

在模型建立時，模型組和HM組大鼠各死亡1只。模型組大鼠注射部位皮膚發生炎癥反應，出現紅色斑點及腫脹，右后爪收縮抬高；注射HM后，大鼠注射部位皮膚炎癥反應減輕，紅色斑點及腫脹減少。

2.2 各組大鼠熱痛閾和機械痛閾測定

與正常組相比，模型組大鼠右后肢熱痛閾顯著縮短、機械痛域明顯降低(P<0.05)，差異均具有統計學意義；與模型組相比，HM組熱痛閾顯著延長、機械痛域明顯升高(P<0.05)。見表1所列。

表1 各組大鼠熱痛閾和機械痛閾比較

2.3 血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量比較

ELISA結果表明，與正常組相比，模型組大鼠血清炎癥細胞因子TNF-α和IL-6含量明顯增高，IL-10含量明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。注射HM后，大鼠血清TNF-α和IL-6含量顯著降低而IL-10含量顯著升高，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2所列。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量(μg/L)

2.4 脊髓中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平

與正常組相比，模型組大鼠脊髓中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平顯著升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，HM組ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。如圖1所示。

圖1 各組大鼠脊髓中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平

2.5 脊髓中ERK1/2 mRNA表達水平

與正常組相比，模型組大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達水平顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，HM組ERK1/2 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。如圖2所示。

圖2 各組大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達水平

3 討論

炎性痛廣泛存在于各種急慢性疾病進程中，臨床主要表現為感覺異常和痛覺過敏，嚴重影響患者生活質量[7]。當炎性疼痛產生時，傷害性刺激可引起外周組織分泌多種細胞因子，炎性細胞因子在病理性疼痛中起著非常重要的作用，可產生痛覺敏感[8]。眭明紅等[9]研究發現，CFA所致的炎性痛動物模型可簡單重復并能準確反映炎性痛的臨床癥狀。本研究通過足底注射CFA構建炎性痛模型，發現模型組大鼠注射部位皮膚發生炎癥反應，出現紅色斑點及腫脹，右后爪收縮抬高；與正常組相比，模型組大鼠術側后肢熱痛閾顯著縮短、機械痛域明顯降低。ELISA結果顯示模型組大鼠血清炎癥細胞因子TNF-α和IL-6含量明顯增高，提示CFA可明顯刺激機體炎性細胞因子的分泌，誘導大鼠建模側后足熱痛敏和機械痛敏。

ERK1/2信號通路的激活會導致疼痛的形成，磷酸化后的ERK可將胞外信號傳到核內[10]。有研究發現，ERK信號通路參與了多種疼痛模型(辣椒素或完全弗氏佐劑致炎、內臟痛、電刺激等)[11-12]。在大鼠神經病理性疼痛模型中，脊髓背角和背根神經節ERK1/2磷酸化水平升高，參與坐骨神經慢性壓迫模型大鼠的痛敏調節[13]。本研究結果發現，模型組大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達水平及ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平均顯著升高，提示炎性痛大鼠ERK1/2信號通路被激活。

氫嗎啡酮是一種比嗎啡更有效的阿片受體激動劑，已經廣泛用于急慢性疼痛的治療[14]。牛富國等[15]研究發現，HM能夠減少剖宮產術后產婦血清中疼痛物質、炎性因子和應激激素的釋放，從而發揮鎮痛作用。本研究在造模1 d后腹腔注射HM，結果顯示大鼠注射部位皮膚炎癥反應減輕，紅色斑點及腫脹減少；與模型組相比，HM組大鼠血清TNF-α和IL-6含量顯著降低而IL-10含量顯著升高，且熱痛閾顯著延長及機械痛域明顯升高；注射HM后，大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達水平及ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平均顯著降低，提示HM可有效地抑制大鼠機體炎癥水平，降低痛覺敏感強度，并能夠降低ERK1/2蛋白磷酸化水平，從而抑制ERK1/2信號通路的活化，可能是其改善大鼠炎癥痛的作用機制。

綜上所述，HM可有效改善CFA誘導的大鼠炎性疼痛，其抗炎鎮痛機制與降低大鼠機體炎性因子的產生并抑制ERK1/2信號通路的活化有關。