香茅醛對銅綠假單胞菌PAO1群體感應的抑制活性研究

曾桃花, 李文茹, 謝小保, 施慶珊 張建設

香茅醛對銅綠假單胞菌PAO1群體感應的抑制活性研究

曾桃花1,2, 李文茹2,*, 謝小保2,*, 施慶珊2, 張建設1

1. 浙江海洋大學, 國家海洋設施養殖工程技術研究中心, 舟山 316022 2. 廣東省科學院微生物研究所, 華南應用微生物國家重點實驗室, 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室, 廣州 510070

多種植物精油及其活性成分被證明具有群體感應(quorum sensing, QS)抑制活性, 可以通過抑制病原菌的QS系統, 減弱甚至消除其毒性和致病性。探究香茅醛對銅綠假單胞菌PAO1 QS系統的抑制活性, 研究香茅醛對QS調控的毒力基因和毒力因子的影響, 對揭示香茅醛的作用機制有一定科學意義。改變香茅醛處理PAO1細胞的濃度與時間, 觀察其生長情況, 測定生物被膜、綠膿菌素、彈性蛋白酶、Pseudomonas quinolone signal(PQS)信號分子的產量, 以及用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測QS系統關鍵基因和相關毒力基因的表達水平。研究發現1.08 mg·mL-1香茅醛不抑制PAO1細胞的生長, 但是顯著下調了QS系統關鍵基因、、、、、和相關毒力基因、、、、、、的表達。1.08 mg·mL-1香茅醛降低了PQS的產量, 對生物被膜的抑制率達到54.4%。2.15 mg·mL-1香茅醛使PAO1細胞培養5 h和24 h時的彈性蛋白酶產量分別減少84.1%和71.6%。0.27 mg·mL-1香茅醛輕微刺激綠膿菌素產生, 0.54、1.08和2.15 mg·mL-1香茅醛減少綠膿菌素的產量。總之, 香茅醛對PAO1具有高效的QS抑制活性, 能下調QS系統關鍵基因和相關毒力基因的表達水平, 能抑制相關毒力因子的產生, 有潛能開發為高效的群體感應抑制劑(quorum sensing inhibitors, QSI)。

香茅醛; 銅綠假單胞菌; 群體感應; 毒力因子; 生物被膜

0 前言

抗生素耐藥性和抗生素污染問題日益嚴重, 新一代抗菌藥物的新靶標研究受到廣泛關注[1–2]。研究發現, QS系統可作為病原菌防治的新靶標[3]。QS是細菌個體與個體之間的一種密度依賴性交流機制, 細菌合成一種被稱為自誘導物質(autoinducer, AI)的信號分子, 并不斷向環境中釋放, AI隨著細菌密度的增加而累積, 當累積到一定濃度閾值時, AI可與信號分子受體蛋白結合并啟動特定基因的表達, 調控細菌的群體行為來適應環境的變化, 如產生毒素、形成生物被膜和抗生素耐藥性等[4]。QSI可以抑制病原菌的毒力和致病力, 但對其生長影響不大, 因而不會為耐藥菌提供有利的選擇壓力[5–6]。銅綠假單胞菌(, PA)是一種條件致病菌, 極易引起燒傷部位、呼吸道、尿道感染, 對健康人影響不大, 但會危及免疫功能低下患者和囊腫性纖維化患者的生命[7]。PA不僅會感染人體, 也會污染水源和食品, 在飲用水和食品中均檢出過此菌[8–9]。研究發現, PA對大多數抗生素極易產生耐藥性, 很難用傳統抗菌藥物根除該菌[10–11]。PA生物被膜的形成和綠膿菌素、彈性蛋白酶等毒力因子的產生都受到其QS系統的調控, 可用QSI取代抗菌劑來降低其耐藥性[12–13]。QSI抗菌藥物的研究對解決PA等致病菌的耐藥性問題具有重要意義。

國內外對QSI已有一定的研究, 最早發現天然來源的呋喃酮類和內酯類化合物都有較強的QS抑制活性, 但是它們在產物中含量低且有毒性, 難以廣泛投入使用[14–15]。為開發高效低毒的QSI, 研究人員開始對呋喃酮等天然QSI進行化學修飾, 化學合成QSI[16–17]]。同時也在不斷尋找新型的天然QSI, 植物來源的QSI具備安全、低毒、環保等優勢, 是QSI抗菌藥物開發的天然寶庫, 研究發現從中草藥、生姜、大豆、大蒜、石榴和大葉黃楊中都能提取出QSI活性物質, 而且大多為萜類和黃酮類化合物, 如兒茶素、薄荷醇、6—姜酚等[18–21]。植物精油是從植物的花、葉、根、樹皮、果實、種子、樹脂等提煉而來, 分子量低、安全、低毒且容易獲取, 而且多種精油及其活性成分被報道具有QS抑制活性, 精油類QSI的研究已經引起廣泛關注[22–24]。研究表明檸檬烯等多種單萜類精油化合物都能抑制PA的QS系統[25]。香茅醛(3, 7—二甲基—6—辛烯醛)也是一種單萜類化合物, 是香茅()油和桉()葉油的主要成分[26–27], 為一種無色至微黃色液體, 具有檸檬香氣和殺蟲抑菌活性, 常用來制作香精、驅蟲劑和防腐劑, 但暫無其在QS方面的研究[28–30]。

本研究通過檢測香茅醛對PAO1 QS系統關鍵基因和相關毒力基因表達水平的影響, 以及對該菌PQS信號分子、生物被膜、彈性蛋白酶和綠膿菌素等毒力因子的影響, 研究香茅醛的QS抑制活性, 為新型PA防治藥物的研發奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、菌株、培養基與培養條件

香茅醛, 純度為96%, 相對密度為0.86, 購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 銅綠假單胞菌PAO1由中國科學院南海海洋研究所提供, 本實驗室保存; LB液體培養基: 10 g·L-1胰蛋白胨, 5 g·L-1酵母粉, 10 g·L-1NaCl; PAO1在LB液體培養基中180 r·min-1、37℃恒溫振蕩培養或靜置培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 銅綠假單胞菌菌懸液制備

參考文獻[26, 31–32]的方法, 將PAO1細胞在LB液體培養基中振蕩培養至對數生長期, 低速離心(4000 r·min-1, 5 min)培養液, 菌體用1×PBS洗滌并重懸, 稀釋至(1—2)×108cfu·mL-1, 備用。

1.2.2 生長情況測定

在《微生物學實驗》(第4版)中細菌生長曲線制作方法的基礎上稍作修改, 比濁測定96孔板中PAO1細胞不同時間段的生長情況[33]。將1.2.1中制備的1—2×108cfu·mL-1指數生長期PAO1菌懸液1: 100加入10 mL LB液體培養基中, 調整起始濃度為1—2×106cfu·mL-1, 處理組再加入不同濃度梯度的香茅醛, 設立空白對照組。取200 μL混合液到96孔板, 每個濃度梯度設3個復孔。37 ℃持續振蕩培養72 h, Tecan Spark多功能酶標儀每隔1 h自動檢測各孔的OD600值, 分析細菌的生長情況。香茅醛的濃度分別為0、0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1。實驗重復3次。

1.2.3 群體感應系統關鍵基因和相關毒力基因的表達水平測定

在100 mL LB液體培養基中加入初始濃度為1—2×108cfu·mL-1的指數生長期PAO1菌懸液和1.08 mg·mL-1的香茅醛, 對照組不加香茅醛, 設立3個平行。振蕩培養5 h后, 12000 r·min-1離心培養液, 收集菌體。按照說明書的方法, 用Vazyme Bacteria RNA Extraction Kit從PAO1細胞中提取總RNA, 并用NanoDrop One超微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和質量。使用PrimeScript RT Master Mix將RNA反轉錄成cDNA, 用SYBR Green Mix進行Real Time PCR反應, 反應分別在ETC811型基因擴增儀和ABI QuantStudio 6熒光定量PCR儀上進行。按照說明書配制10 μL Real Time PCR反應體系(2 × TB GreenII 5 μL; PCR Forward Primer 0.4 μL; PCR Reverse Primer 0.4 μL; ROX Reference Dye II 0.2 μL; cDNA 1 μL;滅菌水3 μL), 每個樣品設置4個重復。反應條件如下: 95℃預變性30 s ; 95 ℃ 5 s , 60 ℃ 34 s ,擴增40個循環。依據NCBI中已測序的PAO1相關基因序列, 用Beacon Designer 7.9軟件設計和的基因引物, 引物序列分別為forward: 5′-CTGACAC GGGCTGGATT-3′,reverse: 5′-AGGCGGTTGC TGAAGAT-3′;forward: 5′-CCTTCGCCAACTC GTC-3′,reverse: 5′-TGTCGGTGCCGTCTTC- 3′。其他基因引物參考文獻[5]報道的引物序列, 以16S rRNA為內參基因, 委托華大基因合成qPCR引物。實驗重復3次。

1.2.4 生物被膜測定

PAO1培養液處理方式同1.2.2, 把添加了混合液的96孔板置于37 ℃恒溫培養箱孵育24 h, 采用Li等[5]的方法分別測定加入0(對照組)、0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1香茅醛之后, PAO1生物被膜的相對含量。簡單來說就是將培養液轉移到新的96孔板中, 測OD600, 得到懸浮細胞濃度。然后將原96孔板用去離子水沖洗干凈并烘干, 0.1% (wt/vol)結晶紫染色10 min, 洗掉染色液, 烘干孔板, 之后加入95%的乙醇脫色, 測OD590。實驗重復3次。

1.2.5 綠膿菌素測定

在100 mL LB液體培養基中接入(1—2)×106cfu·mL-1的指數生長期PAO1菌懸液, 處理組再加入香茅醛, 使其濃度分別為0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1, 陽性對照組不添加香茅醛, 用去離子水作陰性對照。培養液37 ℃, 180 r·min-1連續振蕩培養7 d, 每隔24 h取5 mL培養液提取綠膿菌素。離心培養液, 取上清, 加入3 mL氯仿抽提綠膿菌素, 并用1 mL 0.2 N HCl反萃取氯仿中的綠膿菌素, HCl層溶液變為紅色至深紅色, 測其OD520值, 上清液中綠膿菌素的濃度為(μg·mL-1): OD520×17.072[34]。實驗重復3次。

1.2.6 彈性蛋白酶活性測定

將(1—2)×108cfu·mL-1指數生長期PAO1細胞接種到100 mL LB中, 37 ℃, 180 r·min-1搖床振蕩培養, 分別測定培養5 h和24 h時PAO1的彈性蛋白酶活性。處理組分別加入0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1香茅醛, 陰性對照組用LB培養基提取彈性蛋白酶, 不接種PAO1細胞也不加入香茅醛。離心取0.5 mL上清, 加入10 mg彈性蛋白—剛果紅作為底物和1 mL緩沖液(30 mM Tris-HCl buffer, PH 7.2), 37℃振蕩反應6 h。加入50 μL 0.12 M的乙二胺四乙酸(EDTA)終止反應, 離心取上清, 測OD495值[35]。彈性蛋白—剛果紅被彈性蛋白酶分解后釋放出紅色物質并溶解在緩沖液中, 在495 nm處有最大吸光度, 可以反應彈性蛋白酶的活性大小[36]。實驗重復3次。

1.2.7 信號分子PQS產量測定

PAO1細胞的培養方式和香茅醛處理方法同1.2.3基因表達水平測定, 培養液在37 ℃, 180 r·min-1振蕩培養72 h, 每隔24 h, 12000 × g離心培養液5 min, 并收集上清。在20 mL上清液中加入60 mL乙酸乙酯, 渦旋2 min, 使上清與乙酸乙酯充分接觸。12000 × g離心上清與乙酸乙酯混合液5 min, 使之分層。將50 mL乙酸乙酯層轉移到旋轉瓶, 旋蒸, 直至旋轉瓶完全干燥, 加入1 mL混合液(酸化乙酸乙酯: 乙腈=1:1)重懸PQS。0.22 μm濾膜過濾PQS重懸液, 進行HPLC分析, 采用Shim-pack GIST C18柱 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), 流動相為甲醇—水(90:10 vol/vol), 流速為1 mL·min-1, 檢測339 nm處的波長[6, 37–38]。繪制PQS標準品濃度與峰面積的關系圖, 生成標準曲線, 根據樣品峰面積, 計算出樣品中PQS的產量。實驗重復3次。

1.2.8 數據分析

使用軟件IBM SPSS Statistics 25.0對實驗數據進行檢驗(student'stest), 分析各處理組與對照組之間的差異,<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果和分析

2.1 香茅醛對PAO1細胞生長的影響

圖1為不同濃度香茅醛處理PAO1細胞之后, 用OD600值繪制的生長曲線, 從圖中可看出香茅醛對該菌生長的影響很小。在培養約36個小時之后, 0.27、0.54、1.08 mg·mL-1香茅醛處理組的培養液吸光值均略高于對照組, 此現象的出現可能與低劑量興奮效應相關[39]。隨著香茅醛作用時間增加, 香茅醛有所消耗, 少量的香茅醛反而刺激了細菌增殖。從圖1中可看出這種低劑量興奮效應并不明顯, 而且出現在細菌衰亡階段。因此, 香茅醛不會抑制PAO1細胞的生長。

2.2 香茅醛對PAO1群體感應系統關鍵基因和相關毒力基因表達水平的影響

1.08 mg·mL-1香茅醛處理PAO1細胞之后, 相較于對照組, PA QS系統的關鍵基因和相關毒力基因表達水平的變化情況見圖2。如圖2所示, 共研究了包括QS系統關鍵基因、、、、、和相關毒力基因、、、、、、在內的13個基因, 發現PAO1細胞經香茅醛處理后, 所有基因的表達水平都不同程度下調, 而且下調倍數都大于2,、、、下調尤其明顯。

圖1 不同濃度香茅醛處理下的銅綠假單胞菌PAO1生長曲線

Figure 1 The growth curve ofPAO1 treated with different concentrations of citronellal

注: *表示與對照組相比有顯著差異, **表示與對照組相比有極顯著差異(* P<0.05, ** P<0.01)。

Figure 2 Effect of citronellal on the transcription levels of the key genes in the QS systems and the related virulence genes regulated by the QS systems ofPAO1

2.3 香茅醛對PAO1生物被膜的影響

細菌靜置培養后, 在96孔板內壁形成一圈薄膜, 可以通過結晶紫染色法, 根據OD590值測定生物被膜的相對含量。培養24 h后PAO1細胞生物被膜的形成量如圖3所示, 隨著香茅醛濃度的增加, 生物被膜的形成量顯著減少。處理組對PAO1生物被膜的抑制率均大于40%, 1.08 mg·mL-1處理組對生物被膜的抑制率最高, 為54.4%, 但香茅醛對懸浮細胞濃度的影響很小。

注: OD600表示菌懸液濃度, OD590表示生物被膜相對含量。*表示與對照組相比有顯著差異, **表示與對照組相比有極顯著差異(* P<0.05, ** P<0.01)。

Figure 3 Effect of citronellal onPAO1 biofilm

2.4 香茅醛對PAO1綠膿菌素的影響

綠膿菌素的產量結果如圖4所示, 從圖4(A)可以看出, 在細菌培養的7 d中, 綠膿菌素產量先呈上升趨勢, 在第3或4 d達到最大值, 之后一直下降。細菌濃度在第1 d快速增加, 幾乎達到最大值, 接著小范圍內波動約0.5 d, 之后持續減少。0.54、1.08和2.15 mg·mL-1香茅醛處理組, 7 d都抑制綠膿菌素的產生, 但是無濃度依賴性。PAO1細胞培養的前2 d綠膿菌素產量隨香茅醛濃度的增加而減少, 但2.15 mg·mL-1處理組的綠膿菌素產量從第3 d開始高于1.08 mg·mL-1處理組, 1.08 mg·mL-1處理組的綠膿菌素產量從第4 d開始高于0.54 mg·mL-1處理組。此現象與PAO1細胞生長曲線的衰亡期相似, 香茅醛不斷消耗, 并呈現出低劑量興奮效應, 促進細胞增殖, 產生綠膿菌素, 導致綠膿菌素產量與香茅醛處理濃度成正比。同樣受到低劑量興奮效應的作用, 低濃度0.27 mg·mL-1香茅醛第1 d后就輕微刺激綠膿菌素產生。

總之, 0.54和1.08 mg·mL-1的香茅醛對PAO1綠膿菌素的抑制效果最好, 抑制率高且穩定, 每天的抑制率都高于30%。在綠膿菌素產量最高的第3、4 d, 0.54 mg·mL-1香茅醛對綠膿菌素的抑制率分別為50.1%和46.7%, 1.08 mg·mL-1香茅醛的抑制率分別為65.7%和40.2%。

2.5 香茅醛對PAO1彈性蛋白酶的影響

從圖5可以看出, 不同濃度香茅醛處理PAO1細胞后, LasB彈性蛋白酶的產量明顯減少。從圖5(A)可知, PAO1細胞培養24 h時的彈性蛋白酶產量為5 h時的數倍, 隨著香茅醛濃度增加, 彈性蛋白酶不斷減少。2.15 mg·mL-1香茅醛的抑制率最大, 5 h時為84.1%, 24 h為71.6%。可見香茅醛可顯著抑制PAO1產生彈性蛋白酶。

2.6 香茅醛對PAO1信號分子PQS產量的影響

用HPLC法測定PAO1的PQS信號分子產量, 結果如圖6所示。在細菌培養過程中, PQS產量逐漸增加, 培養72 h時, PQS產量達到最大值。1.08 mg·mL-1香茅醛處理組在處理24、48和72 h時的PQS產量與對照組相比, 均有不同程度的降低, 分別降低了82.0%、82.3%和35.3%。

注: (A)PAO1細胞培養7天中的綠膿菌素的濃度; (B)PAO1細胞培養第3、4天的菌懸液。

Figure 4 Effect of citronellal onPAO1 pyocyanin

注: (A)OD495反應彈性蛋白酶活性; (B)彈性蛋白酶分解彈性蛋白—剛果紅并釋放出紅色物質; *表示與0 mg·mL-1組相比有顯著差異, **表示與0 mg·mL-1組相比有極顯著差異(* P<0.05, ** P<0.01)。

Figure 5 Effect of citronellal onPAO1 elastase LasB

圖6 香茅醛對銅綠假單胞菌PAO1的 PQS信號分子產量的影響

Figure 6 Effect of citronellal onPAO1 PQS molecules

3 討論

本研究分別用0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1的香茅醛處理PAO1細胞, 發現香茅醛在不抑制PAO1細胞生長的情況下, 能抑制PAO1的QS活性。這與之前QSI的相關研究結果一致, Rasmussen等[40]表示QS系統不直接參與細菌生長的必需過程, 因此QSI不抑制或輕微抑制細菌的生長, 不會給耐藥菌提供有利的選擇壓力。Husain等[19]表明亞抑菌濃度(sub-MICs)下的薄荷()油和薄荷醇能干擾N—酰基高絲氨酸內酯(AHL)介導的革蘭氏陰性菌的QS系統。Li等[5]的研究也表明大蒜()精油中的二烯丙基二硫醚可以抑制PA產生毒力因子, 但對其生長無影響。PA至少包含、、三種QS系統, 并呈現出級聯調控特點,系統位于調控網絡的頂層, 正向調控和系統,系統起連接作用,正向調控系統, 并受系統的反向調節[41]。系統包含N-(3-oxododecanoyl)- L-homoserine lactone(3OC12- HSL)信號分子合成酶LasI和信號分子受體蛋白LasR, 分別由和編碼[41–43], 香茅醛處理使和的表達量都顯著下調, 該實驗結果表明香茅醛抑制了系統中3OC12-HSL信號分子合成酶和信號分子受體蛋白編碼基因的表達。和是系統的關鍵基因, 分別負責編碼N-butyryl-L-homoserine lactone(C4- HSL)信號分子合成酶RhlI和信號分子受體蛋白RhlR[41, 44–45]。香茅醛處理使和的表達水平均不同程度的下調, 香茅醛抑制了系統C4-HSL信號分子合成酶和信號分子受體蛋白編碼基因的表達。、和編碼PQS信號分子的合成, PQS與編碼的信號分子受體蛋白PqsR結合, 調控PA的生物被膜、綠膿菌素和彈性蛋白酶[46–47]。香茅醛處理組的和表達水平也顯著低于對照組, 香茅醛抑制了PQS信號分子合成酶和受體蛋白編碼基因的表達, 與基因表達水平下調一致, PQS的產量也顯著降低。以上結果表明, 香茅醛對PAO1的三種QS系統均有明顯的抑制作用, 香茅醛的QS抑制機制很可能是通過抑制信號分子合成酶的活性, 進而抑制信號分子的合成, 干擾QS通路的正常生理功能。PAO1細胞經香茅醛處理后, 其QS系統調控的毒力基因、、、、、和的表達水平也都顯著下調, 它們分別負責不同毒力因子的合成:(LasA蛋白酶)[41]、(LasB彈性蛋白酶)[41]、(胞外多糖合成酶)[48],(綠膿菌素)[41],(外毒素A)[41],(幾丁質酶)[49],(LecB凝集素)[50]。香茅醛處理不僅使PAO1 QS系統調控的毒力基因表達水平下調, 也減少了相關毒力因子的產生, 生物被膜、綠膿菌素、彈性蛋白酶都受到香茅醛的抑制作用。

PA生物被膜難以根除, 極易引起持續性感染, 是該菌產生耐藥性的重要原因之一[51]。Pontes等[52]發現香茅精油及其主要成分香葉醇能抑制金黃色葡萄球菌()的生物被膜形成。Cunha等[53]也表示稀釋之后的香茅精油對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌()有較低的細胞毒性, 但有較強的生物被膜抑制作用。本研究用香茅精油的主要成分香茅醛處理PAO1細胞, 發現香茅醛對PAO1具有較好的生物被膜抑制效應, 香茅醛處理組對生物被膜的抑制率均大于40%, 1.08 mg·mL-1香茅醛的生物被膜抑制率高達到54.4%。雖然香茅醛同香茅精油和香葉醇一樣, 能抑制細菌生物被膜形成, 但香茅醛對革蘭氏陰性菌PAO1無殺菌作用, 而香茅精油和香葉醇對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有較強的殺菌作用[52–53]。此現象與Trombetta等[54]發現單萜類化合物對革蘭氏陽性菌的抗菌作用比對革蘭氏陰性菌強的結論一致。綠膿菌素、彈性蛋白酶都是由PA的QS系統調控的, 是該菌的重要毒力因子[55]。研究表明咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸和香草酸等多種植物的提取物都能抑制PA綠膿菌素的產生[56]。本實驗研究了不同濃度香茅醛處理PAO1細胞后, 7 d內的綠膿菌素含量的變化情況, 發現0.54、1.08和2.15 mg·mL-1的香茅醛連續7 d減少了綠膿菌素的產量, 而且抑制率都高于30%, 0.54和1.08 mg·mL-1的香茅醛作用效果最強。LasB彈性蛋白酶主要受系統和基因的調控[41]。香茅醛抑制了PAO1的系統, 下調了的表達水平, PAO1細胞培養5 h和24 h時彈性蛋白酶的產量, 分別減少了84.1%和71.6%。

目前QSI研究還處于實驗室研究階段, 受試菌株基本生長于培養基, 生長條件比較單一, QSI是否能降低病原菌的感染受到關注。孔晉亮等[57]用PAO1菌株感染大鼠腹腔, 相較于PAO1野生菌株, Δ和Δ雙突變體PAO1菌株(QS系統缺陷)的生物被膜形成能力大大降低, 大鼠的局部炎性反應減弱, 表明PAO1感染動物后, 與培養基中的PAO1一樣, 其毒力因子的產生受QS系統調控, 而且感染能力與毒力基因的表達水平成正比。Haripriyan等[58-59]研究發現丁香精油能抑制PAO1 QS系統毒力基因的表達, 并且能減弱PAO1對秀麗隱桿線蟲的毒力。QSI在治療細菌感染方面存在較大潛力, QSI, 尤其是香茅醛這類天然低毒的QSI研究對解決抗生素耐藥性問題具有重要意義。

4 結論

綜上, 香茅醛通過下調QS系統關鍵基因、、、、、和相關毒力基因、、、、、、的表達水平, 抑制了QS系統信號分子的合成, 從而抑制了QS通路的正常生理功能, 抑制了銅綠假單胞菌PAO1菌株的生物被膜形成, 并抑制了該菌綠膿菌素和彈性蛋白酶的產生。香茅醛對PAO1有較強的QS抑制活性, 又具備植物精油的低分子量、安全性、低毒性且容易獲取等特點, 而且目前尚無此化合物在QS方面的研究, 說明香茅醛在PAO1的防治及在天然QSI抗菌藥物的研發方面都有重要意義。

[1] 劉昌孝. 當代抗生素發展的挑戰與思考[J]. 中國抗生素雜志, 2017, 42(1): 1–12.

[2] 王蘭.抗生素污染現狀及對環境微生態的影響[J].藥物生物技術,2006, 13(2): 144–148.

[3] DEFOIRDT T.Quorum-sensing systems as targets for antivirulence therapy[J].Trends in Microbiology, 2018, 26(4): 313–328.

[4] TURAN N B, CHORMEY D S, BüYüKPINAR ?, et al. Quorum sensing: Little talks for an effective bacterial coordination[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2017, 91: 1–11.

[5] LI Wenru, MA Yongkai, SHI Qingshan, et al. Diallyl disulfide from garlic oil inhibitsvirulence factors by inactivating key quorum sensing genes[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2018, 102(17): 7555–7564.

[6] LI Wenru, ZENG Taohua, XIE Xiaobao, et al. Inhibition of theandin thequorum sensing system and related virulence factors of thePAO1 strain by farnesol[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2020, 151: 104956.

[7] AZAM M W, KHAN A U. Updates on the pathogenicity status of[J]. Drug Discov Today, 2019, 24(1): 350–359.

[8] WU Qingping, YE Yingwang, LI Fei, et al. Prevalence and genetic characterization ofin drinking water in Guangdong Province of China[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 69: 24–31.

[9] 黃結, 蘇頂. 保健食品中檢出銅綠假單胞菌的情況分析[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2015, 25(15): 2495–2496.

[10] PANG Z, RAUDONIS R, GLICK B R, et al. Antibiotic resistance in: mechanisms and alternative therapeutic strategies[J]. Biotechnology Advances, 2019, 37(1): 177–192.

[11] HURLEY M N, CAMARA M, SMYTH A R. Novel approaches to the treatment ofinfections in cystic fibrosis[J]. European Respiratory Journal, 2012, 40(4): 1014–1023.

[12] STRATEVA T, MITOV I. Contribution of an arsenal of virulence factors to pathogenesis ofinfections[J]. Annals of Microbiology, 2011, 61(4): 717–732.

[13] WAGNER S, SOMMER R, HINSBERGER S, et al. Novel strategies for the treatment ofinfections[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 59(13): 5929–5969.

[14] MANEFIELD M, NYS R D, KUMAR N, et al. Evidence that halogenated furanones frominhibit acylated homoserine lactone (AHL)-mediated gene expression by displacing the AHL signal from its receptor protein[J]. Microbiology, 1999,145(2): 283–291.

[15] DONG Y H, WANG L H, XU J L, et al. Quenching quorum-sensing dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase[J]. Nature, 2001, 411(14): 813–817.

[16] HENTZER M, WU H, ANDERSEN J B, et al. Attenuation ofvirulence by quorum sensing inhibitors[J]. The EMBO Journal, 2003, 22(15): 3803–3815.

[17] MCINNIS C E, BLACKWELL H E. Thiolactone modulators of quorum sensing revealed through library design and screening[J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2011, 19(16): 4820–4828.

[18] VANDEPUTTE O M, KIENDREBEOGO M, RAJAONSON S, et al. Identification of catechin as one of the flavonoids frombark extract that reduces the production of quorum-sensing-controlled virulence factors inPAO1[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(1): 243–253.

[19] HUSAIN F M, AHMAD I, KHAN M S, et al. Sub-MICs ofessential oil and menthol inhibits AHL mediated quorum sensing and biofilm of Gram-negative bacteria[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 1–12.

[20] KIM H S, LEE S H, BYUN Y, et al. 6-Gingerol reducesbiofilm formation and virulence via quorum sensing inhibition[J]. Scientific Reports, 2015, 5(1): 1–11.

[21] 趙輝, 馬文靜, 張應杰, 等.基于天然產物的群體感應抑制劑的研究進展[J].生物加工過程, 2019, 17(3): 300– 309.

[22] 王宏年. 幾種植物精油抑菌作用研究[D].楊凌: 西北農林科技大學, 2007.

[23] JARAMILLO-COLORADO B, OLIVERO-VERBEL J, STASHENKO E E, et al. Anti-quorum sensing activity of essential oils from Colombian plants[J]. Natural Product Research, 2012, 26(12): 1075–1086.

[24] NOUMI E, MERGHNI A, ALRESHIDI M M, et al.andPAO1: models for evaluating anti-Quorum sensing activity ofessential oil and its main component terpinen-4-ol[J]. Molecules, 2018, 23(10): 2672–2687.

[25] LUCIARDI M C, BLáZQUEZ M A, ALBERTO M R, et al. Grapefruit essential oils inhibit quorum sensing of[J]. Food Science and Technology International, 2020, 26(3): 231–241.

[26] 李文茹, 施慶珊, 莫翠云, 等. 幾種典型植物精油的化學成分與其抗菌活性[J]. 微生物學通報, 2013, 40(11): 2128–2137.

[27] CHAHOMCHUEN T, INSUAN O, INSUAN W. Chemical profile of leaf essential oils from fourspecies from Thailand and their biological activities[J]. Microche-mical Journal, 2020, 158(150248): 1–8.

[28] 蔣小龍, 寸東義, 楊晶焰. 香茅精油、香茅醛、香茅醇對儲糧霉菌和害蟲抑制與熏殺效果的試驗研究[J]. 鄭州糧食學院學報, 1994, 15(1): 39–47.

[29] NAKAHARA K, ALZOREKY N S, YOSHIHASHI T, et al. Chemical composition and antifungal activity of essential oil from(Citronella Grass)[J]. JARQ- Japan Agricultural Research Quarterly, 2003, 37(4): 249–252.

[30] OuYang Q L, Okwong R O, Chen Y P, et al. Synergistic activity of cinnamaldehyde and citronellal against green mold in citrus fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2020, 162(111095): 1–6.

[31] 李婷婷, 張慧芳, 姜楊, 等. 鯰魚體表粘液粗提物對銅綠假單胞菌的抑菌機理初探[J]. 現代食品科技, 2015, 31(7): 67–73.

[32] 劉惠忠. 惡臭假單胞菌KT2440中(p)ppGpp對生物被膜形成的調控作用[D]. 武漢: 華中農業大學, 2018.

[33] 沈萍, 陳向東. 微生物學實驗[M]. 第4版. 北京: 高等教育出版社, 2007.

[34] ESSAR D W, EBERLY L, HANERO A, et al. Identification and characterization of genes for a second anthranilate synthase in: interchangeability of the two anthranilate synthases and evolutionary implica-tions[J].American Society for Microbiology, 1990,172(2): 884–900.

[35] KARATUNA O, YAGCI A. Analysis of quorum sensing-dependent virulence factor production and its relationship with antimicrobial susceptibility inrespiratory isolates[J].Clinical Microbiology and Infection, 2010, 16(12): 1770–1775.

[36] RUST B L, MESSING C R, IGLEWSKI B H. Elastase assays[J]. Methods in Enzymology, 1994, 235(235): 554–562.

[37] PALMER G C, SCHERTZER J W, MASHBURN- WARREN L, et al. Quantifyingquinolones and examining their interactions with lipids[J]. Methods in Molecular Biology, 2011, 692: 207–217.

[38] XU Xiaohui, YU Hua, ZHANG Di, et al. Role of ppGpp inacute pulmonary infection and virulence regulation[J]. Microbiological Research, 2016, 192: 84–95.

[39] 陶功華. 低劑量興奮效應作用機制的研究進展[J].中山大學研究生學刊(自然科學、醫學版) , 2007, 28(1): 16–21.

[40] RASMUSSEN T B, GIVSKOV M. Quorum sensing inhibitors: a bargain of effects[J]. Microbiology, 2006, 152(4): 895–904.

[41] LEE J, ZHANG Lianhui. The hierarchy quorum sensing network in[J].Protein Cell, 2015, 6(1): 26–41.

[42] PASSADOR L, COOK J M, GAMBELLO M J, et al. Expression ofvirulence genes requires cell-to-cell communication[J]. Science, 1993, 260(5111): 1127–1130.

[43] GAMBELLO M J, IGLEWSKI B H. Cloning and characterization of thegene, a transcriptional activator of elastase expression[J]. Journal of Bacteriology, 1991, 173(9): 3000–3009.

[44] OCHSNER U A, REISER J. Autoinducer-mediated regulation of rhamnolipid biosurfactant synthesis in[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1995, 92(14): 6424–6428.

[45] Ochsner U A, Koch A K, Fiechter A, et al. Isolation and characterization of a regulatory gene affecting rhamnolipid biosurfactant synthesis in[J]. Journal ofBacteriology, 1994, 176(7): 2044–2054.

[46] CAO H, KRISHNAN G, GOUMNEROV B, et al. A quorum sensing-associated virulence gene ofencodes a LysR-like transcription regulator with a unique self-regulatory mechanism[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(25): 14613–14618.

[47] GALLAGHER L A, MCKNIGHT S L, KUZNETSOVA M S, et al. Functions required for extracellular quinolone signaling by[J]. Journal of Bacteriology, 2002, 184(23): 6472–6480.

[48] OVERHAGE J, SCHEMIONEK M, WEBB J S, et al.Expression of theoperon inPAO1 biofilms: PslA performs an essential function in biofilm formation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(8): 4407–4413.

[49] FOLDERS J, ALGRA J, ROELOFS M S, et al.Characterization ofchitinase, a gradually secreted protein[J]. Journal of Bacteriology, 2001, 183(24):7044–7052.

[50] SILVA D P D, MATWICHUK M L, TOWNSEND D O, et al. Thelectin LecB binds to the exopolysaccharide Psl and stabilizes the biofilm matrix[J].Nature Communications, 2019, 10(1): 1–11.

[51] CIOFU O, TOLKER-NIELSEN T. Tolerance and resistance ofbiofilms to antimicrobial agents-howcan escape antibiotics[J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 1–15.

[52] PONTES E K U, MELO H M, NOGUEIRA J W A, et al. Antibiofilm activity of the essential oil of citronella () and its major component, geraniol, on the bacterial biofilms of[J]. Food Science and Biotechnology, 2019, 28(3): 633–639.

[53] CUNHA B G, DUQUE C, CAIAFFA K S, et al. Cytotoxicity and antimicrobial effects of citronella oil () and commercial mouthwashes onandbiofilms in prosthetic materials[J]. Archives of Oral Biology, 2020, 109: 104577.

[54] TROMBETTA D,CASTELLI F,SARPIETRO M G, et al.Mechanisms of antibacterial action of three mono-terpenes[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49(6): 2474–2478.

[55] KARIMINIK A, BASERI-SALEHI M , KHEIRKHAH B.quorum sensing modulates immune responses: An updated review article[J]. Immunology Letters, 2017, 190: 1–6.

[56] UGURLU A, YAGCI A K, ULUSOY S, et al.Phenolic compounds affect production of pyocyanin, swarming motility and biofilm formation of[J].Asian Pacific Journal of Trop ical Biomedicine, 2016, 6(8): 698–701.

[57] 孔晉亮, 王可, 陳一強, 等. 群體感應系統對大鼠腹腔銅綠假單胞菌生物被膜感染的影響[J]. 現代醫藥衛生, 2013, 29(6): 801–802.

[58] HARIPRIYAN J, OMANAKUTTAN A, PANDURANGAN N, et al. Clove bud oil reduces kynurenine and inhibitsgene expression in[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 100(8): 3681–3692.

[59] HARIPRIYAN J, OMANAKUTTAN A, MENON ND, et al. Clove bud oil modulates pathogenicity phenotypes of the opportunistic human pathogen[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 1–12.

Quorum sensing inhibitory activity ofPAO1 by citronellal

ZENG Taohua1,2, LI Wenru2,*, XIE Xiaobao2,*, SHI Qingshan2, ZHANG Jianshe1

1. National Engineering Research Center for Marine Aquaculture, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences, Guangzhou 510070, China

Various essential oils and their effective components have quorum sensing (QS) inhibitory activity. They reduced or even eliminated the pathogen's virulence and pathogenicity by targeting theirQS systems. The aim of this study is to explore the QS inhibitory activity ofPAO1 by citronellal, and to study the effects of citronellal on the virulence genes and virulence factors regulated by the QS systems. This study is of scientific significance to revealing the action mechanism of citronellal. The growth inhibition, biofilm, pyocyanin, elastase, and PQS molecules of the PAO1 straintreated by different concentrations of citronellal were determined in different time. The expression levels of the key genes in the QS systems and the related virulence genes in the PAO1 strain treated by citronellal were analyzed by qRT-PCR. This study found that 1.08 mg·mL-1citronellal did not inhibit the growth of PAO1 cells, but significantly down-regulated the expression of the key genes in the QS systems (,,,,,) and the related virulence genes regulated by the QS systems (,,,,,,). PQS molecules were reduced significantly with 1.08 mg·mL-1citronellal. The inhibition rate of biofilm production was 54.4% by 1.08 mg·mL-1citronellal. The yield of elastase was reduced by 84.1% and 71.6% with 2.15 mg·mL-1citronellal when PAO1 cells were cultured for 5 h and 24 h respectively. The production of pyocyanin was slightly stimulated by 0.27 mg·mL-1citronellal, and reduced by 0.54, 1.08 and 2.15 mg·mL-1citronellal. In short, citronellal had a highly effective QS inhibitory activity against PAO1. Citronellal significantly inhibited the transcription levels of the key genes in the QS systems and the related virulence genes regulated by the QS systems of the PAO1 strain. Moreover, the related virulence factors regulated by the QS systems were reduced after citronella treatment. Therefore, citronellal has potential to be developed as a QS inhibitor against.

citronellal;; quorum sensing; virulence factors; biofilm

曾桃花, 李文茹, 謝小保, 等. 香茅醛對銅綠假單胞菌PAO1群體感應的抑制活性研究[J]. 生態科學, 2021, 40(4): 27–35.

ZENG Taohua, LI Wenru, XIE Xiaobao, et al. Quorum sensing inhibitory activity ofPAO1 by citronellal[J]. Ecological Science, 2021, 40(4): 27–35.

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.04.004

Q939.92

A

1008-8873(2021)04-027-09

2020-12-06;

2021-01-15

廣東省基礎與應用基礎研究基金(2020A1515010850, 2021A1515011080)

曾桃花(1995—), 女, 江西贛州人, 碩士研究生, 主要從事微生物學研究, E-mail: 1879485675@qq.com

李文茹, 女, 博士, 研究員, 主要從事有害微生物防控研究, E-mail: liwenru@gdim.cn

謝小保, 男, 碩士, 研究員, 主要從事有害微生物防控研究, E-mail: xiaobaoxie@126.com