基于網絡藥理學探討4-乙酰氧基苯并噁唑-2-酮對急性肝損傷的作用機制*

張 華，周煥芳，梁英琴，徐萬鵬，孫雪梅，陸俊霏，覃 思，林 軍△

（1.廣西醫科大學藥學院，南寧 530021；2.廣西醫科大學第十附屬醫院，欽州 535000 ；3廣西醫科大學附屬腫瘤醫院藥學部，南寧 530021）

肝臟是人類最重要的器官之一，各種肝損害引起的肝炎是一個世界性的健康問題。急性肝損傷（ALI）是指突然出現大量肝細胞壞死或肝功能顯著異常的綜合征，以凝血機制障礙、黃疸及肝性腦病等癥狀為主要表現，可累及機體多個系統[1]。該病起病急，病情危重，肝細胞廣泛壞死，且目前缺乏有效治療手段，治療藥物的干預效果較差，病死率較高[2]。

中國傳統藥物在治療肝損傷中發揮著重要作用。老鼠簕(Acanthus ilicifolius L.)屬爵床科(Acanthaceae)老鼠簕屬(Acanthus)，是一種重要的藥用紅樹林植物，民間主要用于治療淋巴結腫大、急慢性肝炎、肝脾腫大、胃痛、咳嗽、哮喘，外敷用來治療瘰疬。本課題組前期研究發現，老鼠簕提取物中的單體活性成分為老鼠簕生物堿A，其化學名為4-苯并噁唑-2-酮（HBOA），具有良好的抗炎、抗氧化活性[3]，但由于老鼠簕植物生長緩慢，限制了從中大量的提取，經廣西醫科大學藥學院藥物化學教研室的探索，現已能夠實現全人工合成，并且進一步合成了一系列低毒的HBOA 衍生物[4]，4-乙酰氧基苯并噁唑-2-酮（AcO-BOA）為衍生物之一，根據前期研究結果，AcO-BOA 具有良好的抗炎和保肝作用[5]，但其具體作用機制尚不明確。

網絡藥理學作為藥理學新興分支學科，給中醫藥的發展帶來了新的思路和方法[6]。本研究旨在運用網絡藥理學方法預測并篩選AcO-BOA 和ALI 的交集靶點，進行富集并分析其所參與的生物過程及信號通路，從而探討AcO-BOA 防治ALI 的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 數據庫 所用數據庫包括Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、Phammapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、Gene-Cards 5.0（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）、String 11.0（https://stringdb.org/）、David 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）、Omicshare 5.0.1（https://www.omicshare.com/tools/）、Uniprot（https://www.uniprot.org/）、RCSB PDB（https://www.rcsb.org/）。

1.2 主要材料與試劑 SPF 級健康C57 小鼠，體重（18±22）g，購于廣西醫科大學實驗動物中心，動物使用許可證號：SCXK(桂)2020-0003。AcOBOA，廣西醫科大學藥學院藥物化學教研室合成，純度＞90%。脂多糖（LPS，北京索萊寶科技有限公司，批號：426Y034）；D-氨基半乳糖（D-GalN，合肥博美生物科技有限責任公司，批號：RT052019）。一抗AKT、β-actin（中國Proteintech 公司）；p-AKT（美國Affinity公司）。

1.3 藥物靶點、疾病靶點、藥物與疾病交集靶點的篩選 采用ChemDraw 軟件繪制AcO-BOA 的結構式，分別導入Swiss Target Prediction 及Phammapper數據庫，獲取藥物相關靶點。登陸GeneCards 5.0和OMIM數據庫，分別以“Acute Liver Injury”，“Hepatic Injury”作為關鍵詞進行檢索，從而獲取ALI 相關靶點。登陸Venny 2.1.0網站，分別輸入藥物和疾病的靶點，即可獲得AcO-BOA和ALI的交集靶點。

1.4 蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建及核心靶點的篩選 登陸String11.0 在線網站，輸入AcO-BOA和ALI的交集靶點，物種選擇為“Homo sapiens”，設置隱藏游離靶點，得到PPI 網絡。將PPI 網絡圖.tsv格式文件導入Cytoscape 3.7.1 軟件進行拓撲分析并獲得各節點的中心度值（Degree），根據Degree 值大小將PPI 網絡圖可視化。利用Cytohubba 插件計算并篩選出網絡中Top 10的核心靶點。

1.5 基因功能和通路富集分析及“成分－靶點－通路”網絡圖的構建 將所獲得的Top 10核心靶點輸入David 6.8數據庫，物種選擇為“Homo sapiens”，選擇“office gene”，以P＜0.05 為閾值，篩選出Top 20的生物過程和信號通路。再運用Omicshare5.0.1在線工具繪制動態富集氣泡圖。最后運用Cytoscape 3.7.1 軟件，構建AcO-BOA 與Top 10 核心靶點及Top 20信號通路的“成分－靶點－通路”網絡圖。

1.6 分子對接驗證 配體分子的準備：將配體分子（即AcO-BOA）結構式，保存為mol2 格式。受體分子的準備：登陸Uniprot 數據庫獲取受體分子的ID號，在PDB 數據庫下載各受體的3D 結構，采用Pymol 軟件處理后另存為.pdb 格式。運用AutoDock-Tools-1.5.6 軟件對其進行加氫，計算電荷，設置原子類型處理后，另存為.pdbpt格式。對接：根據受體分子的活性位點，設置對接范圍和計算方法，運用軟件開始對接，運用Pymol軟件對結果進行分析。

1.7 實驗動物分組及給藥 AcO-BOA 用CMC-Na作為溶劑，D-GalN 和LPS 均用生理鹽水作為溶劑。將C57 小鼠隨機分為5 組：正常組、模型組及AcOBOA低劑量（50 mg/kg）、中劑量（100 mg/kg）和高劑量（200 mg/kg）組，每組8只。給藥組按20 mL/kg灌胃相應劑量的AcO-BOA，正常組和模型組灌胃等量CMC-Na，連續10 d。末次給藥后禁食不禁水12 h，除正常組（注射等量生理鹽水）外，其它各組均腹腔注射D-GalN（800 mg/kg）/LPS（40 μL/kg）復制ALI小鼠模型。

1.8 血清堿性磷酸酶（ALP）含量檢測 造模4 h后，將小鼠麻醉后眼球取血，血液靜置1 h 后離心，取上層血清，用全自動生化儀檢測各組小鼠血清中ALP的含量。

1.9 Western blotting法檢測肝組織AKT、p-AKT蛋白表達 取肝組織，稱重后在預冷的研缽中用液氮研磨，加入裂解液，冰上裂解20 min，離心，取上清，加入蛋白上樣緩沖液，混勻，煮沸使蛋白變性，使用SDS-PAGE分離蛋白，轉移至PVDF膜，封閉1 h后；將膜轉移至一抗β-actin(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)，4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜3次；熒光二抗室溫下避光孵育1 h，洗膜；用雙色紅外激光成像系統（美國Odyssey LI-COR 公司）掃膜，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.10 統計學方法 采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析,計量資料以均數±標準差（）表示，各組間均數的比較采用單因素方差分析，方差齊時，兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時，采用Tamhane’sT2檢驗；以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物靶點的篩選 根據Swiss Target Prediction及Phammapper 數據庫的篩選并處理后，共獲得藥物靶點268 個。AcO-BOA 結構式見圖1，其分子量＜200，藥代動力學性質(Pharmacokinetics)中胃腸道吸收系數為高，表明AcO-BOA在胃腸道易吸收；類藥性(Druglikeness)中前5個性質中有4個滿足條件，符合類藥五原則，表明AcO-BOA 在生物體內代謝過程中有較高的生物利用度，更有潛力成為口服藥物。

圖1 AcO-BOA結構式

2.2 疾病靶點篩選結果 分別從GeneCards、OMIM 數據庫篩選出ALI 相關靶點1 906 個和291個，對靶點進行合并，刪除78 個重復值后，共獲得ALI相關靶點2 119個。

2.3 藥物與疾病交集靶點的篩選 分別將268 個藥物靶點和2 119 個疾病靶點導入Venny 2.1.0 網站繪制韋恩圖（圖2），即獲得AcO-BOA防治ALI的潛在靶點，共52個，見表1。

圖2 靶點韋恩圖

表1 AcO-BOA對ALI的保護作用的潛在靶點

2.4 PPI 網絡的構建及核心靶點的篩選 Cytoscape 3.7.1 軟件所繪制的PPI網絡圖如圖3A所示。圖中各節點(Node)表示蛋白，連線(Edge)表示蛋白之間的關聯。各節點大小和顏色與其Degree 值呈正相關，Degree 值越大，節點面積越大，顏色越深。Cytohubba 插件篩選出的Top 10 核心靶點，如圖3B所示。顏色越深，說明該節點越重要。Top 10 核心靶點為絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT1)、表皮生長因子受 體(EGFR)、Toll 樣 受 體4(TLR4)、酪 氨 酸 激 酶(SRC)、Toll 樣受體9(TLR9)、酪氨酸激酶(JAK1)、淋巴細胞特異性酪氨酸激酶(LCK)、β 淀粉樣前體蛋白(APP)、細胞周期檢測點激酶1(CHEK1)和E1A結合蛋白EP300(EP300)，見表2。以上結果提示AKT1在該網絡中的作用更為重要。

表2 前10核心靶點信息

圖3 PPI網絡的可視化圖及核心靶點圖

2.5 基因功能和通路富集分析及“成分－靶點－通路”網絡的構建 GO 分析包括生物學過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)。GO 分析共富集到111 條生物學過程，其中所涉及BP 為77 條，CC 為14 條，MF 為20 條。KEGG 通路富集分析共涉及38條信號通路。運用Omicshare 在線工具，均按照富集基因數目篩選出Top 20 富集結果，以P＜0.05 為閾值，繪制動態富集氣泡圖。

GO 分析結果顯示，Top 20 條生物學過程主要包括先天免疫反應（innate immune response）、細胞對機械刺激的反應（cellular response to mechanical stimulus）、調節細胞增殖（regulation of cell proliferation）等；KEGG通路富集結果顯示，Top 20信號通路中主要包括PI3K-AKT信號傳導途徑（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥途徑（pathways in cancer）、Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等。“成分—靶點—通路”網絡有1 個AcOBOA 節點，10 個基因節點，20 個信號通路節點，共形成64 條連線，根據Degree 值由小到大順時針分布，節點面積越大，說明該節點越重要。可見靶點中AKT1 及通路中PI3K-AKT通路在該網絡中發揮重要作用，見圖4。提示AKT1及PI3K-AKT通路在AcO-BOA防治ALI中具有重要意義。

圖4 富集分析氣泡圖和網絡圖

2.6 分子對接驗證結果 將AcO-BOA 與篩選出的Top 10 靶點進行分子對接驗證。對接結果與結合能大小相關，結合能是指配體和受體分子之間相結合的能力。當結合能＜0 kJ/mol 時，表示化合物與蛋白可以自發結合；結合能＜-5 kJ/mol 時，表明化合物與蛋白之間有較好的結合活性[7]，以此類推，結合能越小，兩者間發生結合作用的可能性越大，并且結合得越穩定。所得對接結果如表3 所示，結果表明，除了TLR9、LCK 兩個靶點不能與AcOBOA 自發結合外，其余靶點均能與AcO-BOA 自發結合，且有較好的結合活性，其中AcO-BOA 與AKT1 的結合能為-5.64 kJ/mol，說明AcO-BOA 與AKT1 能穩定的結合，驗證了上述網絡藥理學所預測的結果，表明AcO-BOA 可能通過調控PI3K-Akt信號通路產生抗肝損傷的藥理作用。利用Pymol軟件對結果進行可視化，見圖5。

圖5 AcO-BOA與核心靶點的分子對接結果圖

表3 分子對接結果

2.7 5 組血清ALP 含量及AKT/p-AKT 蛋白表達量比較 與正常組相比，模型組血清中ALP含量及p-AKT蛋白表達量顯著升高，AKT蛋白表達量顯著降低（均P＜0.01）；與模型組相比，AcO-BOA低、中、高劑量組中ALP含量均顯著降低，AcO-BOA中、高劑量組p-AKT 蛋白表達量顯著降低，AcO-BOA 高劑量組AKT蛋白表達量顯著升高（均P＜0.01），見圖6。

圖6 5組小鼠血清ALP含量及肝組織AKT、p-AKT蛋白表達比較

3 討論

ALI 的病因主要有藥物毒物反應、肝臟脂肪病變、自身免疫性疾病等[8]。肝損傷是急性肝衰竭的基礎，嚴重或持續性肝損傷會導致肝衰竭[9]。對于急性肝衰竭，目前除了肝移植外，臨床上缺乏有效的治療藥物和方法[10]。前期研究結果表明，AcOBOA可以改善四氯化碳所導致的肝纖維化，但其對ALI的具體機制尚不明確，需要進一步探討。

本研究運用網絡藥理學獲取AcO-BOA發揮防治ALI的潛在靶點及信號通路，共得到10個核心靶點，依次是AKT1、EGFR、TLR4、SRC、TLR9、JAK1、LCK、APP、CHEK1 和EP300。蛋白互作關系表明AKT1在Top 10靶點中的作用尤為重要，提示AKT1可能是AcO-BOA 防治ALI 過程中的重要靶點。GO 和KEGG 通路富集結果表明AcO-BOA 防治ALI 過程中主要參與的生物學過程有先天免疫反應、炎癥反應的正調控、調節細胞增殖、蛋白質磷酸化等；主要的信號通路有PI3K-AKT信號傳導途徑、癌癥途徑、Toll 樣受體信號通路、弓形蟲病、甲狀腺激素信號通路、破骨細胞分化等。上述結果表明AcO-BOA 可以通過多靶點，多通路發揮抗肝損傷作用，且AKT1 及PI3K-AKT 信號通路在AcO-BOA防治ALI 中具有重要意義。許多研究表明，PI3KAKT信號通路在防治ALI過程中具有重要地位，如Zhong等[11]研究表明，姜黃素抑制PI3K/AKT通路的激活，促進脂多糖誘導的肝損傷細胞凋亡。

動物實驗結果表明，AcO-BOA 能顯著降低血清中ALP含量，血清中ALP的水平常用于肝臟疾病的診斷與治療，表示AcO-BOA 對小鼠ALI 有一定的保護作用。PI3K-AKT 途徑在細胞中普遍存在，并且在許多疾病發生發展中起著重要作用。牛艷邦[12]研究發現，在Toll 樣受體介導的炎癥發生時抑制PI3K 信號，可以抑制促炎因子的分泌以及增加抗炎因子IL-10的分泌。PI3K/Akt途徑在調節細胞生長、增殖、分化、運動、存活和細胞內運輸中起著關鍵作用[13]。PI3K是該信號通路的關鍵因子，AKT也稱蛋白激酶B，是PI3K下游重要的效應物。PI3K被激活后，生成3位磷酸化的磷脂產物，該產物使得AKT在磷酸肌醇依賴性酶(PDK)的作用下發生磷酸化后進而正性調控細胞周期，促進細胞周期的轉換[14]。動物實驗結果顯示，經LPS/D-GalN 造模后，AcO-BOA 的預處理能下降p-AKT 蛋白的表達，表明AcO-BOA 可以抑制AKT 的磷酸化，抑制PI3K/AKT信號通路，降低LPS所引起的炎癥反應。

綜上所述，本文以ACO-BOA為研究對象，結合網絡藥理學方法，對其發揮ALI 的保護作用機制進行探討。研究結果初步表明，ACO-BOA 能夠有效預防小鼠ALI的發生，其作用機制可能與調控PI3K/AKT信號通路有關，為進一步研究提供了新的思路和理論依據，但仍需深入地對相關靶點和通路進行實驗驗證。