褪黑素對熱打擊后人臍靜脈內皮細胞凋亡的保護作用*

龔 健，古正濤，李 莉，吳啟華，方 楊，鄒志敏，蘇 磊

（1.深圳市龍崗區第三人民醫院重癥醫學科，深圳 518115；2.南方醫科大學第三附屬醫院創傷救治中心、廣東省休克微循環重點實驗室，廣州 510630；3.南部戰區總醫院重癥醫學科、全軍熱區創傷救治與組織修復重點實驗室，廣州 510010）

中暑是發生在我國南方夏季常見的疾病，重癥中暑往往會給人們的健康造成嚴重的危害。目前全球氣溫日益變暖，其發病率亦有逐漸增加的趨勢[1]。重癥中暑不斷研究發現對于各類嚴重并發癥而言，如多器官功能障礙綜合征（MODS），血管內皮細胞(VECs)出現結構或是功能方面的受損是其十分關鍵的影響因素[2]。隨著對重癥中暑機制的深入認識，凋亡的作用受到越來越多的重視，已有研究證實熱暴露后可誘導機體內發生大量的細胞凋亡[3-4]。褪黑素(Melatonin)是一種影響生物晝夜的激素，具有多種生物學功能，包括抗氧化[4-6]、抗炎[7-8]和抗凋亡[9]。本研究通過觀察褪黑素對熱打擊后內皮細胞凋亡所產生的作用，探討褪黑素在中暑救治中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 褪黑素、鈣黃綠素(Calcein)購于MCE公司；胎牛血清、PBS以及DMEM高糖培養基購于Gibco 公司；胰蛋白酶購于Solarbio 公司；CCK-8、Caspase、線粒體膜電位檢測(JC-1)等檢測試劑盒購于Beyotime公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒產品購于BD 公司；激光掃描共聚焦顯微鏡LSM800（Carl Zeiss 公司）；酶標儀（Thermo Fisher MK3）；流式細胞儀（BD公司）；恒溫水浴鍋（蘇珀儀器有限公司）；人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 細胞分組及熱打擊 實驗一分組：褪黑素0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L預處理人臍細胞12 h，分37 ℃常溫組及43 ℃熱打擊組。實驗二分組：根據實驗一結果選出顯著有效的最低劑量作為本實驗褪黑素的實驗劑量，進行分組，包括43 ℃組、43 ℃+褪黑素(43 ℃+Mel)組、37 ℃+褪黑素(37 ℃+Mel)組以及37 ℃組。HUVECs置于細胞培養皿中備用，密度為1.0×105/mL。在進行熱打擊時，先在恒溫水浴鍋（溫度43 ℃）內放置細胞，然后進行時長為2 h 的熱打擊，接著進行6 h 的常規培養（條件為含有5%的CO2，溫度為37 ℃）[10-11]。

1.3 CCK-8 檢測進行細胞活力 收集對數生長期的HUVECs，然后在96 孔板里進行接種（10 000 個/孔），當細胞已經穩定地貼壁之后，再進行分組。將CCK-8溶液（10 μL）添加到各個孔中，通過酶標儀測量450 nm位置的吸光度值。計算細胞存活率，細胞活力（%）=（處理組-空培組）/（陰性對照組-空培組）×100%；陰性對照組：有培養基、CCK-8溶液和細胞的孔的吸光度，空培組：有培養基和CCK-8 溶液而無細胞的孔的吸光度。

1.4 Annexinv-FITC流式細胞儀檢測細胞凋亡

將細胞消化收集起來，置于1.5 mL EP 管中離心5 min 棄上清；加入1 mL PBS 輕輕震蕩清洗細胞2 次，再次離心5 min 棄上清，加入binding bufferv-FITC檢測200 μL輕輕懸浮細胞后加入5 μL Annexin V/FITC 室溫避光孵育15～30 min，每隔10 min 輕彈細胞幾下，再加入200 μL binding buffer 溶液+5 μL 的PI 溶液室溫避光5 min，把孵育好的樣品移至流式管中進行流式細胞儀分析。流式細胞儀測量發射波長Em=530 nm；激發波長Ex=488 nm。

1.5 線粒體膜電位(ΔΨm)檢測 調整待測細胞的濃度為5×105個/mL左右，進行分組處理。按比例混合JC-1 200X 和超純水配制工作液，再加入規定比例的5x JC-1 染色緩沖液，使最終工作液濃度為5～10 μmol/Lol/L。棄去原有的培養基用JC-1 染色緩沖液沖洗2次，添加JC-1染色工作液1 mL并混合均勻，37 ℃的培養箱里面孵育30 min。孵育結束后離心3～4 min 沉淀細胞，丟棄上清液之后使用JC-1 染色緩沖液沖洗2次，加入0.5 mL JC-1染色緩沖液洗滌重懸細胞置放冰上，流式細胞儀分析。JC-1在低濃度的時候以單體的形式存在，看到綠色的熒光顯示。在高濃度的時候的存在形式是多聚體，看到紅色的熒光顯示。

1.6 線粒體通透性轉換孔(MPTP)檢測 細胞分組處理后用胰酶消化，DMEM 培養液重懸，取適量細胞離心5 min，棄上清，加入終濃度為1 μmol/L 的Calcein AM、1μmol/L CoCl2的染色工作液重懸，使細胞為單細胞懸液，且細胞密度為1×106/mL，37 ℃避光孵育30 min，離心5 min 收集細胞。每個樣品加入1 mL DMEM 重懸，離心5min 收集細胞。用400 μL DMEM重懸細胞，染色后流式細胞儀檢測和分析。

1.7 Caspase活性檢測 細胞分組處理后在4 ℃的條件下進行5 min 的離心操作，采集細胞，吸除上清，使用PBS 沖洗1 次，依照每兩百萬細胞添加100 μL 裂解液的關系添加裂解液，冰浴裂解15 min，4 ℃離心10～15 min，將上清液移入冰浴預冷的離心管里面。Caspase-3 活性檢測：40 μL 檢測緩沖液與50 μL 待測樣品/50 μL 裂解液混勻，再加10 μL Ac-DEVD-pNA（2 mmol/L），37 ℃孵120 min；Caspase-9 活性檢測：40 μL 檢測緩沖液與50 μL 待測樣品/50 μL 裂解液混勻，再加10 μL Ac-LEHDpNA（2 mmol/L），37 ℃孵育120 min。用酶標儀測定A405，樣品A405 去除空白對照A405，就是caspase催化得到的pNA吸光度。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料采用均數±標準差()表示，每個實驗至少重復3 次。方差齊時應用單因素方差分析（one-wayANOVA），組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 褪黑素對熱打擊HUVECs活力的作用 褪黑素0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L對37 ℃的HUVECs 活力均無影響（P＞0.05），見圖1a。與褪黑素0μmol/L比較，5μmol/L能增加43 ℃熱打擊HUVECs 的活力（P＜0.05），10μmol/L、20μmol/L顯著增加43 ℃熱打擊HUVECs的活力（P＜0.01），見圖1b。提示10μmol/L褪黑素對熱打擊HUVECs細胞活力有顯著性提高，將該劑量用于實驗二。10μmol/L褪黑素能恢復43 ℃熱打擊HUVECs的活力，43 ℃+Mel 組與37 ℃組和43 ℃組均有顯著性差異（P＜0.05），見圖1c。

圖1 褪黑素對熱打擊HUVECs活力的作用

2.2 褪黑素對熱打擊HUVECs 凋亡的作用 與37 ℃組相比，37 ℃+Mel 組細胞凋亡無統計學意義（P＞0.05）；與43 ℃組比較，43 ℃+Mel 組細胞凋亡減少（P＜0.05）；與37 ℃組、37 ℃+Mel組比較，43 ℃組細胞凋亡增多（P＜0.05），見圖2。

圖2 褪黑素對熱打擊HUVECs凋亡的作用

2.3 褪黑素對于熱打擊HUVECs 線粒體膜電位的作用 與37 ℃組相比，37 ℃+Mel 組JC-1 單位占比差異無統計學意義（P＞0.05）；與43 ℃組比較，43 ℃+Mel組JC-1單體占比降低（P＜0.05）；與37 ℃組、37 ℃+Mel 組比較，43 ℃組JC-1 單體占比增高（P＜0.05），見圖3。

圖3 褪黑素對熱打擊HUVECs線粒體膜電位（JC-1單體占比）的作用

2.4 褪黑素對熱打擊HUVECs MPTP 的作用 與37 ℃組相比，37 ℃+Mel 組鈣黃綠素平均熒光強度差異無統計學意義（P＞0.05）；與43 ℃組比較，43 ℃+Mel 組鈣黃綠素平均熒光強度增加（P＜0.05）；與37 ℃組、37 ℃+Mel組比較，43 ℃組鈣黃綠素平均熒光強度降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 褪黑素對熱打擊HUVECs MPTP的作用

2.5 褪黑素對熱打擊HUVECs caspase-3/9活性的作用 與37 ℃組相比，37 ℃+Mel 組caspase-3/9 活性差異無統計學意義（P＞0.05）；與43 ℃組比較，43 ℃+Mel 組caspase-3/9 活性降低（P＜0.05）；43 ℃組與37 ℃組、37 ℃+Mel組比較，caspase-3/9活性增高（P＜0.05），見圖5。

圖5 褪黑素對熱打擊HUVECs中caspase-3/9活性的作用

3 討論

在中暑的發病過程中，熱是環境致使中暑發生最常見的誘因，會影響機體細胞的結構和功能。熱打擊可激活線粒體途徑人臍靜脈內皮細胞的早期凋亡[11]、可引起神經元細胞[12]、骨骼肌細胞的凋亡[13]。許多的研究數據顯示，細胞凋亡可能在中暑的發病機制中起了重要作用。目前認為細胞凋亡主要有內源性、外源性以及內質網3條轉導途徑，其中外源性途徑也叫做死亡受體途徑；內源性途徑也叫做線粒體途徑[14]。線粒體凋亡通路是細胞凋亡的主要途徑之一。研究證實，幾乎所有的細胞凋亡中均存在細胞跨膜電位(△Ψm)下降。凋亡細胞△Ψm 的下降源于線粒體膜通透性(PT)的改變，PT 的改變受MPTP的調控[15]。許多凋亡信號可以誘導線粒體釋放細胞色素-C，繼而激活了起始Caspase-9，活化的Caspase-9 進一步剪切激活下游效應Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，提示Caspase-9是被線粒體凋亡通路所激活[16]。

松果體是人體主要產生褪黑素的組織，但褪黑素也同時存在于其它組織和器官中，例如皮膚、視網膜、造血細胞、睪丸、胃腸道等[17]。有研究顯示，褪黑素具有緩解失眠、調整飛行時差、調節晝夜節律的功能[18]。深入研究后褪黑素越來越多的作用被了解，褪黑素還有它的代謝物具有廣范抗氧化和清除自由基的作用，并且可以于各種生理病理狀況之下調節很多種類的分子途徑，如凋亡、炎癥、增殖等[19]。大量研究表明，褪黑素具有顯著的抗凋亡作用，可以直接對于MPTP開放起到限制的作用，進而防止細胞凋亡發生[20]。又有研究發現，體外模型中高濃度使用褪黑素會產生促氧化、促凋亡作用。褪黑素在不同細胞的研究中發現，在腫瘤細胞中起促凋亡作用，而正常細胞中起抗凋亡作用[21]。

為探究褪黑素對熱打擊之后的內皮細胞凋亡有無保護效果，首先需要確定褪黑素的實驗劑量，選取不同濃度的褪黑素預處理HUVECs，結果顯示1～20μmol/L的褪黑素對37 ℃組HUVECs活力均無影響，43 ℃組熱打擊后HUVECs活力隨著褪黑素濃度的增加而逐漸恢復。進一步實驗采用了顯著有效的最低劑量，10μmol/L 褪黑素預處理HUVECs，結果表明使用褪黑素10μmol/L 預處理之后的HUVECs 在遇到43 ℃的熱打擊時，細胞活力能得以保持，細胞凋亡明顯減少，提示熱打擊使HUVECs 的凋亡增多，而褪黑素能降低熱打擊后HUVECs的凋亡。同時線粒體膜電位降低的細胞比例(JC-1 單體比例)顯著降低，表明熱打擊會致使HUVECs線粒體膜電位降低，而褪黑素能有助于熱打擊后HUVECs線粒體膜電位的穩定。43 ℃熱打擊會導致HUVECs 的MPTP 一直處于開放狀態，通過褪黑素預處理之后發現熱打擊細胞里面的鈣黃綠素平均熒光強度顯著增加，提示褪黑素有助于減少熱打擊之后HUVECs 的MPTP開放減少。同時，熱打擊導致HUVECs 內caspase-3/9 的活性明顯增高，激活了由其介導的線粒體凋亡途徑，而經褪黑素預處理后caspase-3/9 釋放減少，提示褪黑素能抑制由其介導的線粒體途徑凋亡。

綜上，褪黑素對被熱打擊的內皮細胞凋亡具有保護作用，其機制可能為通過抑制caspase-3/9 介導線粒體途徑，使內皮細胞的線粒體膜電位及線粒體滲透性轉換孔的穩定。褪黑素在熱打擊過程中可減少細胞凋亡并保護線粒體的作用，為臨床上重癥中暑的救治提供實驗根據。