七氟烷逆轉氧糖剝奪—復糖復氧誘導的小膠質細胞炎性反應*

趙 璐，侯俊德，陳永學

（邯鄲市中心醫院麻醉科，邯鄲 056018）

創傷性腦損傷等中樞神經系統疾病的發展和轉歸中的炎癥反應有重要作用，由小膠質細胞介導免疫反應能夠促進病原體清除及組織修復再生，但炎癥反應可加劇對神經元的損傷[1-3]。因此，臨床中應積極尋求有效干預措施，以抑制小膠質細胞的活化，以減輕腦損傷后神經元損傷及促進中樞神經系統損傷修復[4]。七氟烷為臨床常用麻醉藥物，且在兒童全麻誘導及維持中療效良好，研究發現，給予氧糖剝奪的神經元七氟烷干預，可促進HO-1-mRNA的表達，降低Fas蛋白的表達，降低人神經元的凋亡率，增加存活率[5-6]。但目前尚未明確其具體作用機制。NF-κB 存在于幾乎所有動物細胞類型中，并參與細胞對刺激的反應，且可調節感染的免疫應答過程，而NF-κB 信號通路在經典通路、旁路通路和非典型通路中均被激活，具有重要的調節作用，而小膠質細胞被認為是存在于腦內的巨噬細胞，可表達NF-κB[7-9]，推測七氟烷或可降低小膠質細胞誘導的炎性反應且其機制可能與NF-κB 信號通路有關。為此，本研究探討七氟烷處理對氧糖剝奪—復糖復氧（OGD/R）N9 細胞的影響，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

七氟烷（丸石制藥株式會社，進口藥物注冊證號：H20090714）。胎牛血清（FBS）和DMEM（美國Gibco 公司）；細胞培養板（德國Corning 公司）；MTT（美國Sigma 公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物有限公司）；ELISA 試劑盒（上海康成生物有限公司）；二甲基亞砜（上海凌峰化學試劑有限公司）；NO 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗NF-κB（稀釋比例1∶800）（美國SAB 公司）；蛋白提取試劑盒（南京凱基生物有限公司）；大鼠抗CD11b（稀釋比例1∶200）（美國Abcam 公司）；蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物研究所）。電轉系統C（美國miniprotein-Ⅲwet transfer unit，Bio-Rad 公司）；PVDF 膜（美國Millipore 公司）；ECL（美國Thermo Scientific 公司）。本研究經本院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 細胞培養與分組

N9 細胞來源于小鼠，其細胞結構、功能及形態與小膠質細胞類似，細胞培養于含10% FBS 的DMEM 完全培養基中，培養環境37 ℃、5%CO2。隨機分為對照組、七氟烷+對照組、OGD/R組、七氟烷+OGD/R 組。其中對照組不做任何處理；七氟烷+對照組給予七氟烷處理30 min；OGD/R組給予行氧糖剝奪4h，復糖復氧24 h；七氟烷+OGD/R組在OGD/R組的基礎上給予七氟烷處理30 min。

1.3 構建OGD/R模型

將正常細胞培養液替換為無糖DMEM 培養基，于37 ℃，5%CO2和95%N2混合氣體的培養箱內氧糖剝奪4 h，換為正常細胞培養液后再培養24 h。將細胞培養瓶置于密閉容器內，通過七氟烷揮發罐將不同濃度的（0、0.5%、1.0%、1.5%）七氟烷和含有95%N2及5%CO2的混合氣體連續吹入進氣口，并在出氣口處連接呼吸末氣體檢測儀，置于37 ℃恒溫孵箱內孵育120 min。孵育結束后棄去舊培養基，加入含10%FBS的DMEM培養液洗脫30 min。

1.4 LDH活性檢測

各組細胞隨機取5 孔，細胞濃度稀釋為1×105/mL，接種于24 孔板內，氧糖剝奪4 h，每孔吸取50 μL 培養基，加入適量LDH 測定試劑，于37 ℃下孵育30 min，采用分光光度計于490 nm 處檢測OD值，以反映LDH含量。

1.5 MTT活性檢測

將各組細胞稀釋為5×104個/mL后接種于96孔板內，培養細胞直至其貼壁位置，在各細胞孔內加入20 μL MTT 溶液（5 mg/L），置于37℃培養箱培養4 h，棄上清液在每孔內均加入150 μL DMEM，振蕩并反應10 min后，采用分光光度計于490 nm處檢測OD值。

1.6 TNF-α、IL-1β及NO 含量檢測

收集各組細胞，嚴格按照ELISA 試劑盒操作說明書進行操作。每組隨機取5 孔細胞，濃度為1×105/mL，接種于24 孔板，氧糖剝奪4 h，每孔加入500 μL 培養液，復糖復氧24 h，吸取等體積培養液，加入相應抗體包被過的96 孔板，孵育30 min采用分光光度計于490 nm 處檢測OD 值，NO 的含量檢測則用分光光度計于550 nm處檢測OD 值，以間接計算NO含量。

1.7 免疫熒光化學法檢測CD11b表達水平

收集各組細胞棄除細胞培養基，用預冷的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）緩沖液洗滌細胞3 次。用4%多聚甲醛室溫固定細胞10 min，再用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌1次。分別加入一抗（大鼠抗CD11b，稀釋比例1∶200），4 ℃過夜。0.01 mol/L PBS 緩沖液洗滌1次，加入二抗（稀釋比例1∶5 000）并在37 ℃下孵育1 h，0.01 mol/L PBS 緩沖液洗滌細胞1次，加入終濃度為1 μg/mL 的熒光染料室溫孵育5 min。

1.8 NF-κB 蛋白的表達水平檢測

收集各組細胞棄上清液，加入裂解液并將細胞刮下，采用BCA 法測定細胞總蛋白含量。沸水煮5 min 使蛋白預變性。取30 μg 蛋白樣品，12%SDS-PAGE 膠電泳分離,利用電轉系統C 轉至PVDF 膜，10%脫脂奶粉-TBST（pH 7.5，10 mmol/L Tris-HCI，150 mmol/LnaCl，0.1%Tween-20）室溫封閉1 h，加入一抗（稀釋比例1∶200），4 ℃過夜。TBST 洗滌3次，加入二抗（稀釋比例1∶10 000）并在室溫孵育1 h。ECL發光底物染1 min。Omega 16IC全自動化學發光凝膠成像系統顯影分析。

1.9 統計學方法

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行作圖及統計分析。計量數據用均數±標準差（）表示，服從正態分布和方差齊性的數據采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 N9細胞的活性

七氟烷濃度為0時，N9細胞經OGD/R后，MTT活性無改變（P＞0.05），但LDH 活性增加（P=0.023）；對照組N9 細胞給予不同濃度的七氟烷（0.5%、1.0%和1.5%）后，LDH、細胞的活性均未改變（P＞0.05）；OGD/R 組N9 細胞給予不同濃度的七氟烷后，隨著濃度的增加細胞活性明顯增加（P＜0.05），但LDH 活性明顯降低（P＜0.05），當七氟烷濃度為1.5%時，效果最為明顯，見圖1。

圖1 七氟烷逆轉OGD/R誘導的小膠質細胞活力的降低

2.2 ELISA 實驗檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β及NO的含量

N9 細胞經OGD/R 后，炎癥因子TNF-α、IL-1β及NO 的含量均較對照組升高（均P＜0.05）；給予1.5%的七氟烷后，對照組N9細胞的TNF-α、IL-1β及NO 的含量均無明顯變化（均P＞0.05），但OGD/R組N9 細胞的TNF-α、IL-1β 及NO 的含量明顯降低（均P＜0.05），見圖2。

圖2 七氟烷降低OGD/R誘導的小膠質細胞TNF-α、IL-1β及NO的含量

2.3 免疫熒光化學法檢測CD11b表達水平

正常狀態下，CD11b 表達在N9 細胞胞膜與細胞質中（圖3A）。N9細胞OGD/R后，CD11b 表達水平較對照組N9 細胞升高（P＜0.05）；給予1.5%的七氟烷后，對照組N9 細胞的CD11b 表達水平無明顯變化（P＞0.05），但OGD/R組N9細胞的CD11b 表達水平明顯降低（P＜0.05，圖3B）。

圖3 七氟烷抑制OGD/R 誘導的小膠質細胞表面分子CD11b 的表達

2.4 Western blot 實驗檢測NF-κB 蛋白表達水平

N9 細胞OGD/R 后，細胞核內NF-κB 蛋白表達水平較對照組N9 細胞升高（P＜0.05）；給予1.5%的七氟烷后，對照組N9 細胞的NF-κB 蛋白表達水平無明顯變化（P＞0.05），但OGD/R 組N9 細胞的NFκB 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 七氟烷抑制OGD/R誘導的小膠質細胞NF-κB 蛋白的表達

3 討論

腦缺血再灌注損傷和修復過程中炎性反應均有重要作用，依據炎性反應的程度和反應時間的不同，可對神經元產生保護或者損傷的效果[10]。發生缺血性卒中后小膠質細胞可在短時間內激活，并釋放TNF-α、IL-β、NO等炎性因子，并誘導細胞黏附分子表達，誘導大量白細胞聚集并穿過血管壁，浸潤腦組織，進一步加重神經元損傷[11-12]。本研究中，與正常N9細胞比較，OGD/R組細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β 及NO 的含量升高。分析其原因，細胞因OGD/R后受到刺激導致氧化和抗氧化能力失衡，引起大量TNF-α、IL-β、NO 等炎性因子的釋放，導致OGD/R組細胞炎癥因子的含量顯著上升[13-14]。CD11b是小膠質細胞的標志物，小膠質細胞活化時，CD11b 表達上調，當細胞過度激活出現凋亡時CD11b 表達下降[15]。本研究亦發現，N9 細胞OGD/R后，CD11b 表達水平較正常N9細胞升高，提示N9細胞氧糖剝奪—復糖復氧模型制備成功，可用于后續實驗。

有研究發現，使用2%七氟烷預處理2 h 后洗脫30 min能夠減少隨后缺氧和血清剝奪誘導的骨髓間充質干細胞（MSCs）凋亡，且不會增加正常培養MSCs 的凋亡[16]。亦有學者提出，高于2.3%的七氟烷孵育4 h可誘發細胞死亡或形態學的變化[17-18]，說明七氟烷濃度＜2.3%時安全有效。進一步研究結果顯示，盡管OGD/R 組N9 細胞隨著七氟烷處理濃度的增加細胞活性也不斷增加，但LDH活性明顯降低，而當七氟烷濃度為1.5%時，效果最為明顯，因此考慮選擇濃度為1.5%的七氟烷進行后續實驗。

NF-κB 廣泛存在于真核細胞內，且在多種基因轉錄調控中均有重要作用，參與多種病理生理過程[19-20]。NF-κB不僅表達于神經元內，亦可表達于血管內皮細胞及膠質細胞中，當發生腦缺血再灌注損傷后，NF-κB的轉錄活性增強[21-22]。激活NF-kB能夠降低氧化應激反應及興奮性毒性所造成的神經元損傷，當敲除NF-κB 基因后，腦缺血再灌注損傷程度加重[23-24]。本研究發現，七氟烷預處理的OGD/R N9 細胞的培養液中胞核NF-κB 蛋白表達水平降低。提示七氟烷處理的OGD/R N9細胞損傷緩解可能與NF-κB信號通路的活性抑制有關，擔尚需更多的實驗研究證實。由于NF-κB 涉及到多種基因的表達，其能夠受限識別TNF-α 等基因的啟動因子，并與啟動序列中的共同序列相結合以使各炎性因子水平升高[25-26]。因此，本實驗結果進一步說明七氟烷使各炎性因子水平降低，緩解神經炎性反應，其機制可能與NF-κB信號通路有關，但是否通過抑制NF-κB 信號通路進而降炎性因子的水平仍有待下一步驗證。

綜上所述，七氟烷可降低OGD/R誘導的小膠質細胞炎性反應，其機制可能與抑制NF-κB信號通路有關。