黃芪多糖對腹主動脈縮窄大鼠心肌肥厚及自噬的影響*

陳廣琴，白法文，洪鈺杰

（廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院心內科，南寧 530000）

自噬(autophagy)是普遍存在于真核細胞中高度保守的代謝過程，生理條件下自噬通過選擇性降解胞內蛋白和受損細胞器，對維持細胞內環境穩態至關重要，但過度自噬將導致自我消化而加重損傷[1]。研究表明，在心肌肥厚的發展過程中，ATP合成減少可促進自噬活性升高，自噬的激活有助于改善心肌肥厚，但是持續的自噬激活進一步加重線粒體損傷，從而導致心臟結構和功能異常[2]。黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是從豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根中提取的水溶性多糖成分。最近的離體研究及在體動物實驗均顯示，APS 具有抑制心肌肥厚的保護作用[3-4]。本課題組前期研究也證實，APS對主動脈縮窄所致的大鼠心肌肥厚有保護作用，其抑制心肌肥厚的機制與激活AMPK，改善心肌能量代謝有關[5]。APS是否可通過調控自噬，發揮抑制心肌肥厚的保護作用，目前尚未見有報道。本研究建立腹主動脈縮窄（AAC）術致心肌肥厚大鼠模型，觀察APS 對模型大鼠術后LC3Ⅱ/GAPDH、beclin-1 表達及自噬小體數量的影響，初步探討APS對壓力超負荷大鼠心肌肥厚及心肌細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠60 只，體質量200～300 g，購自廣東省實驗動物中心（動物許可證批號：SYXK（粵2017014），飼養于廣東省實驗動物中心。

1.2 藥物、試劑與儀器

1.2.1 主要藥物和試劑 APS（上海麥克林生物技術有限公司），批號：C10062382，純度＞70%。兔LC3BⅠ抗（CST，貨號：#43566），兔beclin-1Ⅰ抗（CST，貨號：#3495），IgG-HRP 標記的抗兔Ⅱ抗（SANTA CRUZ，貨號：sc-2004），GAPDH（abcam，貨號：Ab181602）。組織細胞總蛋白抽提試劑盒P1250（考馬斯亮藍法）（北京普利萊基因技術有限公司）。

1.2.2 主要儀器 LG2000 型數碼凝膠圖像分析系統(杭州朗基科學儀器有限公司)。Mini型蛋白電泳系統（美國Bio-rad 公司）。Hitachi H7500 型電子顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物及造模 24 只健康SD 大鼠，結扎大鼠腹主動脈制備心肌肥厚模型，隨機分為模型（AAC）組、APS 組，具體方法參照文獻[6]。假手術（Sham）組：12 只SD 大鼠，僅分離腹主動脈不結扎。手術后1周開始灌胃給藥，APS組給予APS 400 mg/kg·d-1。以滅菌蒸餾水溶解APS，調整濃度，使每次灌胃容量在2 mL 左右；其余兩組均每天給予2 mL滅菌蒸餾水。共8周。

1.3.2 心肌肥厚指數的測定 8 周后，空腹大鼠稱重后處死，取出心臟稱重，再分離出左心室稱重。計算心臟質量指數(heart mass index，HMI)=心臟重量（mg）/大鼠總體重（g），左心室質量指數(left ventricular mass index，LVMI)=左心室的體重（mg）/大鼠總體重（g）。

1.3.3 蘇木精－伊紅（HE）染色及測量心肌細胞直徑和表面積 左室心肌組織以4%甲醛固定后石蠟包埋。按5 μm 厚度連續切片5～6 片，常規脫蠟脫水后行HE染色15 min，中性樹膠1～2滴封片。顯微鏡下拍照(×400)，觀察心肌細胞形態及纖維排列；每個切片隨機選取80～100 個橫切的左心室心肌細胞(要求盡量呈圓形)，測量其直徑及橫截面積，取平均值。

1.3.4 Western blotting 檢測心肌組織LC3Ⅱ/GAPDH、beclin-1 的蛋白表達量 冰上取心肌組織，每100 mg心肌加入500 μL裂解液(RIPA裂解液)，提取心肌組織總蛋白。BCA法蛋白定量、變性，制膠，上樣，電泳分離及冰上轉膜。洗膜后孵Ⅰ抗：LC3B（1∶1 000）、beclin-1（1∶1 000），4 ℃冰箱過夜。孵HRP標記的抗兔Ⅱ抗(1∶2 000)，室溫，1 h。ECL發光，X-光膠片曝光檢測。以GADPH 作為內參，用IPP6.0圖像分析軟件分析蛋白灰度。

1.3.5 電鏡標本制備及檢測 剪取1～2 cm2心肌組織，以2.5%多聚甲醛和戊二醛固定；4 ℃冰箱過夜，取出后予0.1 mol/L 磷酸漂洗液漂洗數次；2%鋨酸后固定30 min，脫水；此后于50%、70%、80%、90%、100%乙醇中依次漂洗，時間為10～15 min；100%丙酮浸透和包埋；Epon812 環氧樹脂再次包埋于多孔橡膠包埋模板中，烘干；超薄切片后予檸檬酸鉛染色。于電鏡下攝片，觀察自噬體數量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件對數據進行統計學什么，計量資料以均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HMI、LVMI及心肌細胞直徑、表面積結果

與Sham組比較，AAC組大鼠HMI、LVMI、心肌細胞直徑和心肌細胞表面積明顯增加(P＜0.01)，表明大鼠已出現心肌肥大。與AAC組比較，APS組大鼠HMI、LVMI、心肌細胞直徑和心肌細胞表面積明顯降低(P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠HMI、LVMI、心肌細胞直徑和心肌細胞表面積的比較 ，n=12

表1 各組大鼠HMI、LVMI、心肌細胞直徑和心肌細胞表面積的比較 ，n=12

與Sham組比較，aP＜0.01；與AAC組比較，bP＜0.01。

2.2 心肌組織HE染色結果

與Sham組比較，AAC組心肌纖維束增寬，肌纖維間隙變寬，疏松水腫，心肌纖維肥大，排列紊亂，組織中可見炎癥細胞浸潤間質增大；與AAC 組比較，APS組病理變化明顯改善，心肌纖維束縮小，間隙變窄，心肌細胞排列較整齊，組織中炎癥細胞浸潤間質變小，見圖1。

圖1 HE染色觀察APS對大鼠心肌細胞形態的影響（HE，×400）

2.3 心肌組織LC3Ⅱ/GAPDH、Beclin-1的蛋白表達水平

與Sham 組比較，AAC 組心肌組織中LC3Ⅱ/GAPDH 及beclin-1 水平明顯升高（P＜0.05）；與AAC 組比較，APS 組LC3Ⅱ/GAPDH 及beclin-1 水平明顯下降（P＜0.05），見圖2。

圖2 蛋白免疫印跡檢測各組大鼠心肌組織中LC3Ⅱ/GAPDH、beclin-1蛋白表達

2.4 電鏡檢測心臟組織中自噬小體

在電子顯微鏡下觀測自噬小體數量，圖中呈新月狀或杯狀，外為雙層或多層膜，內有包繞胞漿成分如線粒體、溶酶體等的囊泡即為自噬小體，AAC組自噬小體明顯增加，而APS 組自噬小體數量較AAC組明顯減少，見圖3。

圖3 電鏡下各組大鼠心肌組織自噬小體的數量，箭頭指自噬小體

3 討論

APS 是從膜莢黃芪或蒙古黃芪的根部中提取的水溶性多糖成分，由APSⅠ和Ⅱ組成；具有調節免疫、降糖降脂、抗炎、抗氧化和抗病毒的藥理活性[7]。在心血管系統中，APS 在心肌再灌注損傷及糖尿病心肌病變中的心肌保護作用已被大量研究證實，其機制與抗氧化應激、減少心肌細胞凋亡等有關，涉及多個信號轉導通路[8-9]。近年來，離體及在體研究均有報道APS 抑制心肌肥厚的保護作用。如章櫻[3]培養離體心肌細胞，異丙腎上腺素誘導其肥大，并使用APS 干預，結果顯示APS 可抑制心肌細胞肥大，其機制可能與抑制TLR4活性、阻斷NF-KB 及CaMK Ⅱ信號通路，減少炎癥反應有關。另有研究報道，APS通過改善心肌能量代謝紊亂和提高線粒體的活力抑制腹主動脈縮窄所致大鼠心肌肥厚[6]，本課題組前期研究也證實，APS對腹主動脈縮窄所致大鼠心肌肥厚具有保護作用，其機制可能與APS 激活AMP/p38 MAPK 信號通路有關[5]；為進一步探究APS抑制心肌肥厚的機制，進行了如下研究。

本實驗結果顯示，AAC 組大鼠HMI、LVMI、心肌細胞直徑和心肌細胞表面積均顯著增加；HE 染色提示心肌結構異常，呈心肌肥厚病理改變。而給予APS 治療后，大鼠HMI、LVMI、心肌細胞直徑和心肌細胞表面積均較AAC組明顯降低，APS組心肌肥厚程度明顯減輕(P＜0.01)。提示APS 可以有效抑制腹主動脈縮窄誘導的大鼠心肌肥厚。

自噬是一種具有高度保守性的生命過程，適當的自噬活性對于維持細胞的能量代謝穩態是必不可少。然而，過度激活的自噬會通過非選擇性降解正常的線粒體和線粒體相關蛋白，加重線粒體損傷和能量代謝障礙，形成能量紊亂的惡性循環，導致細胞死亡[1]。心肌細胞中的自噬活性與心肌肥厚和心衰的發生密切相關，適當的自噬有利于抑制心肌肥厚的進展，但自噬的過度激活最終導致心力衰竭[10]。小鼠行胸主動脈縮窄術（TAC）后，自噬相關基因ATG5、LC3-Ⅱ和beclinl 等自噬標志物的表達增加，提示在TAC 誘導的心肌肥厚中，自噬被激活[11]。恢復自噬的正常表達有助于抑制心肌肥厚及改善心功能，如芪藶強心膠囊可通過激活AKT/mTOR通路抑制過量自噬減輕異丙腎上腺素所致心肌細胞損傷[12]，大蒜素則可通過激活PI3K/Akt/mTOR 控制過度自噬，減輕AngⅡ誘導的心肌細胞肥大及腹主動脈縮窄誘導的大鼠心肌肥厚[13]。本研究發現隨著心肌肥厚的出現，AAC組大鼠心肌組織中LC3Ⅱ/GAPDH、beclin-1 表達明顯升高，心肌細胞中的自噬小體顯著增加（P＜0.05），提示自噬的過度激活可能在病理性心肌肥厚的進展中發揮作用。

近年來，相關研究表明，APS 可通過調控心肌組織中的自噬水平發揮保護作用，黃芪預處理可恢復阿霉素抑制的自噬從而減輕心肌損傷，改善心功能[14]。另有研究報道，APS 可能通過上調心肌細胞內自噬水平而抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡，發揮心臟保護作用[9]。在壓力超負荷誘導的心肌肥厚中，APS 對自噬的調控尚未明確。LC3/Atg8和Beclin-1/Atg6 是用于檢測自噬水平的最常見兩種標志物。本研究結果顯示，APS 處理后，LC3Ⅱ/GAPDH、beclin-1 表達明顯下降，自噬體數量減少（P＜0.05），表明自噬活性受到了有效抑制，同時，心肌肥厚得到明顯改善，提示APS對自噬的抑制可能是其保護心肌肥厚的重要機制之一。

綜上所述，APS 能抑制壓力超負荷大鼠心肌肥厚，其分子機制可能與APS 抑制自噬的表達有關。然而，涉及的具體信號通路仍未明確。尤其是我們的前期研究提示APS 可激活AMPK，而有趣的是，在心肌肥厚中，AMPK 對自噬的調控仍存在爭議，大量研究表明AMPK 可促進自噬反應改善心肌肥厚[15]；但也有報道表明，在心肌肥厚向心衰的過渡階段，AMPK 可通過抑制自噬的表達而改善心功能[16]。在本研究中，APS 對自噬的調控是否與AMPK有關尚未明確，具體機制有待進一步實驗探討。