miR-449a-5p調控Bax對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響及其機制研究

唐 莉，唐國英

（重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院，重慶 405400）

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性肺炎最常見的病原體。肺上皮細胞排列在呼吸道上，構成了對抗呼吸道病原體的天然防線，感染后，肺部會出現明顯的炎癥反應，肺泡上皮細胞的凋亡是細菌性肺部感染的主要病理特征[1]。miRNA作為細胞內的重要調控分子，在細胞凋亡信號轉導過程中發(fā)揮關鍵作用[2]。戢慧等[3]采用基因芯片技術篩選和RT-PCR驗證Ⅱ型肺泡上皮細胞（AECⅡ）凋亡相關miRNA 時發(fā)現，miR-449a-5p在模型中表達下調，miR-449a-5p可能在AECII 凋亡調控中起關鍵作用。但miR-449a-5p 對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響機制目前還不清楚。本研究以AECⅡ細胞為研究對象，通過細胞轉染和肺炎鏈球菌干預后，探討miR-449a-5p在肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡中的作用，以期為肺炎的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DMEM/F12 培養(yǎng)基、Annexin VFITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、Western blot 相關試劑購于北京索萊寶公司；胎牛血清購于Hyclone 公司；LipofectamineTM 2000 相關轉染試劑購于Invitrogen 公司；白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒購于上海紀寧公司；BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega 公 司；miR-NC、miR-449a-5p mimics、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Bax、WT-Bax和MUT-Bax的構建和測序由上海生工公司提；Bcl-2 抗體、Bax 抗體、GAPDH 抗體和HRP 標記的Ⅱ抗均購于Abcam 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、實驗分組和處理 AECⅡ由本實驗室分離于健康雄性SD 大鼠，并經純化和鑒定。用DMEM/F12 培養(yǎng)基在37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)，24 h 后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后備用。將AECⅡ細胞分為6組：對照組、肺炎鏈球菌組、miR-NC 組（轉染miR-NC）、miR-449a-5p組（轉染miR-449a-5p mimics）、miR-449a-5p+pcDNA3.1 組（轉染miR-449a-5p mimics 和pcDNA3.1）和miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax 組（轉染miR-449a-5p mimics 和pcDNA3.1-Bax），當肺炎鏈球菌組、miR-NC 組、miR-449a-5p 組、miR-449a-5p+pcDNA3.1 組和miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax 組AECⅡ細胞細胞融合度達到90%時，用濃度為1×108CFU/mL 的肺炎鏈球菌培養(yǎng)AECⅡ細胞，其中miR-NC組、miR-449a-5p 組、miR-449a-5p+pcDNA3.1 組和miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax 組在肺炎鏈球菌干預前48 h 進行轉染。對照組為正常培養(yǎng)的AECⅡ細胞。

1.3 細胞轉染 取對數生長期的AECⅡ細胞，按照每孔4×105個細胞數接種于6孔板，當細胞融合度達到60%時，按照LipofectamineTM2000 使用說明將miR-NC、miR-449a-5p mimics 分別轉染AECⅡ細胞，于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。為驗證miR-449a-5p 是通過調控Bax 表達影響肺炎鏈球菌誘導的細胞凋亡，將miR-449a-5p mimics 和pcDNA3.1-Bax同時轉染至AECⅡ細胞。

1.4 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測miR-449a-5p的表達 取按照上述分組進行處理的各組AECⅡ細胞，培養(yǎng)24 h 后TRIzol 法提取各組細胞的總RNA，逆轉錄合成cDNA，以U6 為內參，qPCR 檢測并用2-ΔΔCt法計算各組AECⅡ細胞中miR-449a-5p的表達水平。引物序列如下：miR-449a-5p 上游引物5’-GGGTTAAGACTTGCAGT-3’，下游5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6 上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATT-TGCGT-3’。

1.5 ELISA法檢測IL-6和IL-10含量 取按照上述分組進行處理的各組AECⅡ細胞，培養(yǎng)24 h后收集細胞培養(yǎng)液上清液，參照IL-6 和IL-10 ELISA 檢測試劑盒說明書法檢測IL-6和IL-10含量。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 取按照上述分組進行處理的各組AECⅡ細胞，培養(yǎng)24 h 后，收集細胞，用結合緩沖液調整使細胞濃度為1×106個/mL。每管加入100 μL的AECⅡ細胞，再向管中加入5 μL的Annexin V-FITC，室溫避光混勻，10 min 后，加入5 μL的PI，室溫避光孵育5 min后，加入PBS至500 μL，輕輕混勻后進行上機檢測。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測 利用生物信息軟件TargetScan 進行靶基因預測發(fā)現miR-449a-5p 與Bax 的3’UTR 之間存在部分互補配對的核苷酸序列，猜測miR-449a-5p 與Bax 存在靶向調控關系，并進行驗證。構建野生型WT-Bax和突變型MUT-Bax的Bax-3’UTR 熒光素酶報告基因載體，利用LipofectamineTM2000 將miR-449a-5p mimics 和miR-NC分別與WT-Bax 和MUT-Bax 共轉染AECⅡ細胞，培養(yǎng)48 h后，測定各組AECⅡ細胞的熒光素酶活性。

1.8 Western blotting檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達

取按照“1.3”項進行處理的各組AECⅡ細胞，培養(yǎng)24 h 后，用RIPA 裂解液于冰上裂解各組細胞，提取細胞蛋白。BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白樣品濃度。取適量已煮沸變性蛋白樣品用SDS-PAGE分離細胞蛋白，電泳完畢后，將細胞蛋白轉移到PVDF膜上。用Western封閉液搖床封閉60 min，吸盡封閉液后，Western洗滌液洗膜10 min，洗3次后，加入已稀釋的抗Bax 和Bcl-2 抗體室溫孵育2 h，再次用Western洗滌液洗膜3次后，加入已稀釋的Ⅱ抗室溫繼續(xù)孵育1 h，ECL顯影后拍照，以GAPDH為內參，用Image J軟件分析目的蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺炎鏈球菌對細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 如表1 和圖1 所示，肺炎鏈球菌作用后的AECⅡ細胞分泌的促炎因子IL-6 含量顯著升高，抗炎因子IL-10含量顯著降低，AECⅡ細胞的凋亡率顯著增加（P＜0.05）。表明肺炎鏈球菌能夠誘導AECⅡ細胞凋亡和炎癥反應。

表1 肺炎鏈球菌對細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

表1 肺炎鏈球菌對細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

圖1 肺炎鏈球菌對細胞AECⅡ凋亡的影響

2.2 肺炎鏈球菌對細胞AECⅡ中miR-449a-5p表達的影響 如表2所示，與對照組相比，肺炎鏈球菌作用后的AECⅡ細胞miR-449a-5p的表達水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 肺炎鏈球菌對細胞AECⅡ中miR-449a-5p表達的影響 ，n=9

表2 肺炎鏈球菌對細胞AECⅡ中miR-449a-5p表達的影響 ，n=9

2.3 過表達miR-449a-5p對肺炎鏈球菌作用的細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 如圖2、表3 所示，與miR-NC 組相比，miR-449a-5p 組AECⅡ細胞中miR-449a-5p 的表達顯著升高，Bcl-2 蛋白的表達水平顯著升高，Bax 蛋白的表達水平顯著降低，IL-10的分泌量顯著升高，IL-6的分泌量顯著降低，細胞的凋亡率顯著降低（P＜0.05）。提示，過表達miR-449a-5p 能夠拮抗肺炎鏈球菌對AECⅡ細胞的凋亡促進作用，能夠抑制肺炎鏈球菌對炎癥因子的作用。

圖2 過表達miR-449a-5p對肺炎鏈球菌作用的細胞AECⅡ凋亡蛋白表達的影響

表3 過表達miR-449a-5p對肺炎鏈球菌作用的細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

表3 過表達miR-449a-5p對肺炎鏈球菌作用的細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

2.4 miR-449a-5p 靶向調控Bax 的表達 如圖3A所示，miR-449a-5p與WT-Bax的3’UTR之間存在部分互補的核苷酸序列。表4顯示，當上調miR-449a-5p表達后，轉染WT-Bax的3’UTR熒光素酶報告基因載體的AECⅡ細胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而轉染MUT-Bax 的3’UTR 熒光素酶報告基因載體的AECⅡ細胞的熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）。表5 和圖3B 顯示，當上調miR-449a-5p表達后，AECⅡ細胞Bax蛋白的表達顯著降低；當下調miR-449a-5p 表達后，AECⅡ細胞Bax 蛋白的表達顯著升高（P＜0.05）。提示，Bax 是miR-449a-5p 的靶基因，miR-449a-5p 可負性調控Bax 的表達。

圖3 miR-449a-5p靶向、調控Bax

表4 雙熒光素酶報告實驗 ，n=9

表4 雙熒光素酶報告實驗 ，n=9

表5 miR-449a-5p調控Bax的表達 ，n=9

表5 miR-449a-5p調控Bax的表達 ，n=9

與miR-NC組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

2.5 過表達Bax能逆轉miR-449a-5p對肺炎鏈球菌作用的細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的作用 如表6和圖4顯示，與miR-NC組相比，miR-449a-5p組AECⅡ細胞Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，Bax蛋白的表達水平顯著降低，IL-6 的分泌量顯著降低，IL-10的分泌量顯著升高，細胞凋亡率顯著降低；與miR-449a-5p+pcDNA3.1組相比，miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax 組AECⅡ細胞Bcl-2 蛋白的表達水平顯著降低，Bax蛋白的表達水平顯著升高，IL-6的分泌量顯著升高，IL-10 的分泌量顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。以上結果表明，過表達Bax能逆轉miR-449a-5p對肺炎鏈球菌作用的細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的作用。

圖4 過表達Bax 能逆轉miR-449a-5p 對肺炎鏈球菌作用的細胞AECⅡ凋亡蛋白表達的影響

表6 過表達Bax能逆轉miR-449a-5p對肺炎鏈球菌作用的細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

表6 過表達Bax能逆轉miR-449a-5p對肺炎鏈球菌作用的細胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

與miR-NC組比較，*P＜0.05；與miR-449a-5p+pcDNA3.1組比較，#P＜0.05。

3 討論

肺泡上皮細胞分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型肺泡上皮細胞覆蓋肺泡的大部分表面，是氣體交換的部位，AECⅡ分泌表面活化劑降低肺泡表面張力對穩(wěn)定肺泡大小具有重要意義[4]。Rai 等[5]研究表明，肺炎鏈球菌分泌過氧化氫，引起肺泡上皮細胞DNA損傷和凋亡，DNA的損傷程度和肺泡上皮細胞凋亡程度相關。肺泡上皮細胞的損傷導致體液不平衡是肺炎發(fā)展中的重要步驟。細胞凋亡是導致肺炎發(fā)病機制中肺泡上皮細胞防御功能喪失的重要機制。本研究發(fā)現，肺炎鏈球菌處理AECⅡ細胞后，細胞的凋亡率顯著增加，抗炎因子IL-10分泌量顯著降低，促炎因子IL-6分泌量顯著升高（P＜0.05），這與王勇等[6]的研究結果相一致，表明AECⅡ細胞凋亡模型構建成功。

miR-34/449 家族是一類在進化中高度保守的miRNA，在3 個基因組位點上通常包含6 個同源基因：miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-449a、miR-449b和miR-449c。miR-449a-5p是近年來新發(fā)現的miRNA，隸屬于miR-34/449 家族。目前，關于miR-449a 對細胞凋亡調控的研究主要集中惡性腫瘤中。Liu等[7]研究發(fā)現，miR-449a在肝癌細胞中表達下調，過表達miR-449a 可誘導肝癌細胞G1 期阻滯和細胞凋亡。Li 等[8]研究發(fā)現，過表達miR-449a 可抑制胃癌細胞增殖，促進胃癌細胞凋亡。此外，miR-449a 還可靶向Bcl-2 促進骨肉瘤細胞凋亡[9]。本研究中，用肺炎鏈球菌處理AECⅡ細胞后，qPCR檢測顯示，AECⅡ細胞中miR-449a-5p 的表達顯著降低（P＜0.05）。推測，miR-449a-5p 的表達下調與肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡有關。

在肺泡上皮細胞的凋亡過程中，多種凋亡凋亡相關蛋白參與其中。促凋亡蛋白Bax 是Bcl-2 家族的主要成員，Bax主要聚集在細胞質中，通過調控線粒體膜轉換孔形成，促進細胞色素C 的釋放。隨后細胞色素C 與凋亡相關因子Apaf-1 結合，促使caspase-9 活化，激活caspase 級聯(lián)反應促進細胞凋亡[10]。而Bcl-2則抑制細胞色素C釋放，從而發(fā)揮負性調控作用。細胞因子在肺炎中扮演重要角色，抗炎因子分泌減少和促炎因子分泌增多導致引起自身組織細胞損傷和全身炎癥反應綜合征的發(fā)生。本研究中，AECⅡ細胞轉染miR-449a-5p mimics后，用肺炎鏈球菌處理細胞，發(fā)現AECⅡ細胞的凋亡率顯著降低，細胞中Bax 蛋白的表達和IL-6 含量顯著降低，Bcl-2蛋白的表達和IL-10含量顯著升高（P＜0.05）。提示，過表達miR-449a-5p 可抑制肺炎鏈球菌對炎癥因子的作用，拮抗肺炎鏈球菌誘導的肺泡上細胞凋亡。

近年來，miRNA通過調控Bax表達參與對細胞凋亡的調控被廣泛報道。Wang等[11]研究發(fā)現，人退行性核髓細胞中Bax 的表達顯著上調，miR-573 通過靶向下調Bax抑制核髓細胞凋亡是椎間盤退變治療的新型有效策略。Zhou等[12]研究發(fā)現，miR-208b通過靶向下調Bax 表達保護H9c2 細胞免受缺氧誘導的細胞凋亡。Liu等[13]研究表明，miR-214通過靶向Bax 對神經細胞凋亡也有阻礙作用。此外，miR-145[14]、miR-477a[15]、miR-339[16]等多種miRNA 都可通過靶向調控Bax表達參與細胞凋亡的調控。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗和Western blot 檢測證實miR-449a-5p 可靶向負性調控Bax 的表達。表明miR-449a-5p 通過下調Bax 表達拮抗肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡，這與王勇等[17]沉默Bax減弱TNF-α誘導的人肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡結論相吻合。為進一步證實miR-449a-5p是通過下調Bax表達進而影響肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡，進行回補實驗，發(fā)現過表達Bax 能逆轉miR-449a-5p 對肺炎鏈球菌作用對AECⅡ細胞凋亡及炎性因子分泌的影響。提示miR-449a-5p通過靶向下調Bax 表達減弱肺炎鏈球菌誘導的AECⅡ細胞凋亡。

綜上所述，肺炎鏈球菌處理可增加肺泡上皮細胞促炎因子IL-6 的分泌，減少抗炎因子IL-10 的分泌，促進細胞凋亡，miR-449a-5p 通過靶向下調Bax表達可減弱肺炎鏈球菌對肺泡上皮細胞的影響。本研究的發(fā)現為靶向miR-449a-5p治療肺炎奠定了理論基礎，為肺炎的治療提供新的思路。