單倍體造血干細胞移植治療伴陣發性睡眠性血紅蛋白尿克隆的重型再生障礙性貧血的臨床效果

劉珍珍，盧潤青，謝新生，姜中興，何飛，樊冀鑫，趙海秋，郭榮

(鄭州大學第一附屬醫院 血液內科，河南 鄭州 450052)

陣發性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)與再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)關系密切，有研究報道PNH克隆可見于50%以上的初診AA患者，部分起病時PNH克隆陰性的AA患者接受免疫抑制治療(immunosuppressive therapy，IST)后PNH克隆轉陽[1-2]。臨床上伴PNH克隆的AA不易與PNH鑒別，表現為骨髓造血衰竭的PNH更難與AA等疾病鑒別。PNH患者熒光標記的嗜水氣單胞菌溶素變異體(fluorescent aerolysin，FlAER)試驗缺失率多高于20%，而伴PNH克隆的AA患者FLAER試驗缺失率多低于20%[3]。但仍有部分AA患者初診時PNH克隆可達60%～90%[1,4]。根據溶血和血栓形成風險，將PNH克隆>50%定義為大克隆，10%～50%為中克隆，<10%為小克隆[5-6]，PNH克隆大小與AA患者血管內溶血風險呈線性相關[7]，而PNH克隆大小及演變對AA患者移植療效的影響尚不清楚。重型再生障礙性貧血(severe aplastic anemia，SAA)起病急、進展快，IST起效慢，復發率高，且易克隆演變為急性白血病，首選人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)全相合同胞供者異基因移植，而對于缺乏全相合供者的SAA患者，已有研究證實單倍體造血干細胞移植(haploid hematopoietic stem cell transplantation，haplo-HSCT)是一種安全有效的治療方案[8]。而PNH克隆大小對SAA患者haplo-HSCT療效的影響報道較少，且多為單中心小樣本研究[9]。本研究回顧性分析5例接受haplo-HSCT的伴PNH克隆的SAA患者的臨床資料，探討PNH克隆對haplo-HSCT療效的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2018年2月至2020年3月于鄭州大學第一附屬醫院接受haplo-HSCT治療的5例伴PNH克隆(4例大克隆，1例中克隆)的SAA患者的臨床資料。5例患者均為男性，年齡19～35歲，中位年齡21歲。診斷標準參照《再生障礙性貧血診斷與治療中國專家共識(2017年版)》[10]并經FlAER流式細胞術檢測外周血 CD55/CD59 陰性紅細胞、粒細胞、單核細胞(>5%定義為PNH克隆陽性)。初診時PNH克隆大小為42.48%～74.74%，中位數為57.33%，無溶血等臨床表現，酸化血清溶血試驗、糖水試驗、蛇毒因子溶血試驗及尿含鐵血黃素試驗等均為陰性。診斷至移植時間為3～9個月，中位時間4個月，移植前治療包括環孢素A、成分輸血、雄激素及細胞生長因子等，血象、骨髓增生程度等未見明顯好轉，移植前復查PNH克隆大小為22.49%～62.62%，中位數為61.34%。供者選擇按照鄭州大學第一附屬醫院常規順序(HLA相合同胞供者、HLA相合無關供者、HLA單倍體相同供者)確定，本研究中5例患者均為HLA單倍體供者，其中同胞單倍體供者4例，父親供者1例。HLA位點相合度為5/10～7/10。所有患者均在移植前簽署知情同意書。見表1。

表1 5例伴PNH克隆的SAA患者的一般臨床資料及供者情況

1.2 預處理方案采用BU+ FC+ATG方案預處理，具體如下：白消安(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.，國藥準字H20150289)靜脈滴注，3.2 mg·kg-1·d-1，2 d；氟達拉濱(重慶萊美藥業股份有限公司，國藥準字H20059418)靜脈滴注，30 mg·m-2·d-1，4 d；環磷酰胺(Baxter Oncology GmbH，國藥準字H20060467)靜脈滴注，40 mg·kg-1·d-1，4 d；兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白(Genzyme Polyclonals S.A.S，批準文號S20150036)靜脈滴注，2.5 mg·kg-1·d-1，4 d。預處理期間給予保肝、護胃、水化、堿化、利尿及靜脈滴注美司鈉(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字H10950007)解救等對癥支持治療。

1.3 移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)預防口服環孢素A(國藥集團川抗制藥有限公司，國藥準字H10940044)和霉酚酸酯(國藥集團川抗制藥有限公司，國藥準字H20080724)、靜脈滴注甲氨蝶呤[Pfizer(Perth)Pty Limited，國藥準字H20140205]預防GVHD，全血環孢素A谷濃度控制在150～250 μg·L-1。例3患者由于移植前使用環孢素A出現肝功能損傷，將環孢素A改為西羅莫司(華北制藥股份有限公司，國藥準字H20100079)口服治療，全血西羅莫司谷濃度控制在5～10 ng·L-1。

1.4 造血干細胞采集與回輸供者經粒細胞集落刺激因子10 μg·kg-1·d-1動員后，于第5天采集外周血造血干細胞，其中例3、例4供者采集外周血造血干細胞前在局麻下于髂后上棘采集骨髓液300～400 mL。回輸的單核細胞數為(6.68～10.16)×108kg-1，中位數為7.72×108kg-1，CD34+細胞數為(5.50～11.47)×106kg-1，中位數為6.40×106kg-1。

1.5 造血重建及植入評價粒細胞植入定義為中性粒細胞絕對計數持續3 d>0.5×109L-1，血小板植入定義為無血小板輸注情況下血小板持續7 d>20×109L-1，首日分別為粒細胞和血小板植入時間。采用性染色體熒光原位雜交、DNA短串聯重復序列、血型檢測等作為受者植入指標。

1.6 其他并發癥的預防移植前9 d至移植后30 d持續靜脈滴注低劑量肝素鈉(齊魯制藥有限公司，國藥準字H20030428)(血小板<20×109L-1時停用)、熊去氧膽酸(Bruschettini S.r.l，國藥準字H20150398)、前列腺素E1(北京泰德制藥股份有限公司，國藥準字H10980023)預防肝靜脈閉塞病。移植前2～9 d靜脈滴注噴昔洛韋(浙江尖峰藥業有限公司，國藥準字H20070186)或阿糖腺苷(大同五洲通制藥有限公司，國藥準字H20084023)預防巨細胞病毒感染，之后改為阿昔洛韋片口服。移植后每周檢測外周血巨細胞病毒DNA拷貝量，陽性者給予更昔洛韋(浙江亞太藥業股份有限公司，國藥準字H20045825)或膦甲酸鈉(正大天晴藥業集團股份有限公司，國藥準字H20000442)靜脈滴注治療。靜脈滴注卡泊芬凈(Merck Sharp & Dohme Ltd.，國藥準字H20171218)或伏立康唑(麗珠集團麗珠制藥廠，國藥準字H20064493)預防真菌感染。口服復方磺胺甲噁唑(山東新華制藥股份有限公司，國藥準字H37020649)預防肺孢子蟲病。

1.7 隨訪采用住院檢查、門診及電話聯系對所有患者進行隨訪。隨訪截止日期為2021年1月1日，隨訪時間為10～25個月，中位隨訪時間為15個月。

2 結果

2.1 造血重建及植入評價5例患者移植后均快速獲得造血重建，粒細胞及血小板中位植入時間分別為14、16 d。造血重建后經短串聯重復序列、性染色體熒光原位雜交及血型檢測均證實為完全植入。其中1例患者(例3)于移植后48 d出現繼發性植入功能不良，給予艾曲波帕口服、造血生長因子(粒細胞集落刺激因子、血小板生成素)皮下注射及輸注血制品等治療，未見明顯效果。后皮下注射阿扎胞苷(Baxter Oncology GmbH，國藥準字H20170238)，每日100 mg，使用3 d，28 d為1個療程，共應用4個療程，第1個療程結束14 d后復查血常規，中性粒細胞、血紅蛋白及血小板較前明顯回升，4個療程后血常規恢復正常。在隨訪期內，5例患者血常規均正常，嵌合率均為100%。

2.2 GVHD及其他移植并發癥GVHD：1例患者(例3)于移植后9個月發生慢性GVHD(皮膚3分)，給予糖皮質激素治療，西羅莫司改為他克莫司，癥狀未見明顯好轉，后給予間充質干細胞治療，癥狀逐漸好轉，未再發生GVHD相關表現；其余4例患者均未發生急性及慢性GVHD。感染性并發癥：1例患者(例2)出現巨細胞病毒血癥，給予抗病毒治療后巨細胞病毒DNA定量逐漸降至正常；1例患者(例4)出現口腔黏膜炎，病原菌為多耐藥銅綠假單胞菌，根據藥敏試驗結果，抗感染治療后逐漸好轉。其他并發癥：1例患者(例2)于移植后98 d經PET-CT及組織活檢明確診斷為巨細胞病毒相關移植后淋巴組織增殖性疾病(肝、結腸)，環孢素A減量至停藥，同時給予抗病毒治療及靜脈輸注丙種球蛋白，并依次給予R-COP方案(利妥昔單抗+環磷酰胺+長春地辛+潑尼松)化療2個療程，利妥昔單抗(Roche Pharma AG，批準文號S20170002)單藥治療2個療程，治療結束后復查PET-CT提示肝內多發低密度結節消失，結腸回盲部周圍軟組織體積較前明顯縮小，代謝活性降低，最大攝取標準值約1.5，現隨訪至移植后23個月，未見移植后淋巴組織增殖性疾病復發表現；1例患者(例3)出現出血性膀胱炎(Ⅲ度)，給予水化、堿化、膀胱沖洗、抗病毒等治療后好轉。截至隨訪結束，5例患者均未發生疾病復發、肝靜脈閉塞病、移植相關血栓性微血管病及血栓等并發癥。

2.3 移植后PNH克隆演變及WT1基因表達PNH克隆：5例患者移植后1個月FlAER流式細胞術檢測外周血PNH克隆均轉陰。隨訪期內多次復查PNH克隆均為陰性，均未轉化為臨床型PNH。未出現血栓事件、溶血，多次查膽紅素、乳酸脫氫酶、酸化血清溶血試驗、糖水試驗等均未見異常。WT1基因表達：2例患者(例3、例4)為鑒別骨髓增生異常綜合征等疾病，采用聚合酶鏈式反應技術檢測WT1基因，結果提示其表達升高(10.2/100～12.8/100)，移植后1個月復查WT1基因，結果提示其降至正常范圍(正常范圍為<0.5/100)，移植后定期檢測WT1表達水平，波動于0/100～0.76/100。

3 討論

PNH是一種罕見的獲得性造血干細胞基因突變引起的克隆性疾病[11]，即使給予最佳的支持治療，其5 a病死率高達35%[12]。而PNH克隆不僅存在于PNH患者，也可見于AA等疾病。FlAER試驗是檢測PNH克隆的新方法，具有更高的特異度和靈敏度[13]。60%的AA患者伴有PNH克隆，其中10%～25%可能表現出克隆擴增并進展為臨床PNH[11]。臨床上伴PNH克隆的AA等不易與PNH鑒別，表現為骨髓造血衰竭的PNH更難與伴PNH克隆的AA等疾病鑒別。研究表明，經典型PNH患者PNH克隆明顯大于伴PNH克隆的AA患者[6]，伴PNH克隆的AA患者FlAER試驗缺失率多低于20%[3]，但仍有部分AA患者伴有PNH大克隆。PNH患者中可出現WT1基因表達升高，PNH患者的異常克隆細胞在敲除WT1基因后增殖能力減弱，提示WT1的過表達可能參與PNH患者異常克隆的優勢增殖過程[14]。Shichishima等[15]發現PNH患者WT1mRNA表達水平與PNH克隆有關，且其表達水平高于AA組和正常對照組。可通過檢測WT1基因定量初步鑒別伴PNH克隆的AA與PNH等疾病。然而，伴PNH克隆的AA患者WT1基因表達情況目前尚不清楚，本研究中有2例患者移植前檢測了WT1基因，結果提示其表達均升高，移植后PNH克隆消失，WT1基因也轉陰，提示伴PNH克隆的AA患者WT1基因表達水平升高，但需要擴大樣本量后進一步研究證實。伴PNH克隆的AA與PNH等疾病的鑒別診斷仍然是臨床工作的難點及重點，尤其是少數合并中/大克隆的AA患者，需全面考慮患者的病史、血管內溶血等臨床表現及PNH克隆大小、WT1基因表達情況等指標。

SAA是一種嚴重的骨髓造血衰竭性疾病，根據再生障礙性貧血診斷與治療中國專家共識(2017年版)[10]，對于年齡≤35歲的SAA患者，首選HLA相合同胞供者異基因造血干細胞移植，其造血重建快，克隆性疾病發生率低，長期生存率高。無同胞全相合供者的SAA首選免疫抑制劑治療。而對于伴PNH克隆的SAA患者，PNH克隆大小及其演變對預后的影響尚不明確。關于PNH克隆對接受IST的SAA患者的影響，已有研究報道了相互矛盾的結果[7,16-17]。目前相對一致的觀點是，AA患者初診時PNH克隆多為小克隆(<10%)且較穩定，部分患者PNH小克隆可消失，故初診時伴PNH小克隆的AA患者，可按照AA給予規范性治療，定期隨訪觀察，檢測PNH克隆變化即可。對于PNH克隆較大的AA患者，有研究發現PNH克隆大小與血管內溶血的發展呈線性關系[7]，轉化為臨床PNH的可能性較大。然而抗胸腺細胞球蛋白、環孢素等免疫抑制劑起效較慢，治療中易出現PNH克隆的擴增[18]。Lian等[5]對133例伴PNH克隆的AA患者進行免疫抑制劑治療，其中34例(25.6%)PNH克隆較大，患者在中位隨訪時間11個月內出現血管內溶血，而異基因造血干細胞移植造血重建快。Lee等[19]對33例PNH或AA-PNH綜合征患者行異基因造血干細胞移植，結果顯示PNH克隆約在移植后2個月內轉陰。劉立民等[20]報道了40例接受異基因造血干細胞移植(單倍型移植25例，全相合同胞移植15例)的PNH患者，對36例移植后存活的患者多次隨訪發現PNH克隆均為陰性。然而，目前關于異基因造血干細胞移植在伴PNH大克隆的SAA患者中研究較少。本研究中5例伴PNH克隆的SAA患者，4例為大克隆(PNH克隆>50%)，1例為中克隆(PNH克隆為42.48%)，均具有移植適應證，且缺乏HLA相合同胞供者，綜合評估并結合患者意愿后行haplo-HSCT，PNH克隆均在移植后1個月轉陰，未出現移植相關死亡，初步證實單倍體移植對伴PNH克隆的SAA患者可能具有一定的療效。

異基因造血干細胞移植仍是SAA患者的一線治療方案，對于伴PNH克隆的SAA也是如此[9]。移植供者的選擇順序通常是HLA相合同胞供者、HLA相合無關供者、單倍型供者。然而只有25%～30%的患者可找到全相合同胞供者[21-22]，而查找無關供者耗時較長，可能會延誤大部分SAA患者的治療時機。haplo-HSCT作為重要的替代供者移植類型，幾乎所有患者均可找到單倍體供者，且等待時間較短，供者依從性高。研究證實haplo-HSCT在SAA、PNH及AA-PNH綜合征等疾病中顯示出很好的療效[8,20,23]。但GVHD、感染及植入失敗/延遲植入等仍是SAA患者移植失敗的主要原因。隨著預處理方案、GVHD預防方案及感染防治的進展，單倍體移植在SAA中已取得與全相合移植類似的療效。盡管PNH克隆常見于SAA患者，但是關于SAA移植療效的報道很少考慮到PNH克隆的存在[21]。Gavriilaki等[9]對3例伴PNH大克隆(61%～82%)的SAA患者行造血干細胞移植，2例死于移植后早期急性GVHD及血栓相關多器官功能障礙綜合征。但新的治療方案可能會改善伴PNH大克隆的SAA患者的預后。有研究報道，對于PNH克隆較大的患者，移植前應用C5抑制劑Eculizumab橋接移植，或可減少血栓形成的風險，對于單倍體及無關供者移植同樣有效[24]。也有研究認為移植后給予Eculizumab維持治療，可預防移植后血栓形成，且不增加感染、植入失敗等風險[25]，盡管如此，預處理過程中仍可能會出現補體激活，從而增加血管內溶血的風險，異基因造血干細胞治療伴PNH克隆的SAA患者仍有諸多挑戰，移植前后需定期檢測患者PNH克隆大小及演變，預防血栓、血管內溶血的發生。本研究對5例伴PNH克隆的SAA患者行單倍體移植，其中1例出現繼發性植入不良，1例出現慢性GVHD，1例出現移植后淋巴組織增殖性疾病，均在治療后好轉，在隨訪時間內無移植后死亡病例，未發生PNH轉化及PNH克隆相關溶血、血栓事件，可能與診斷至移植時間較短有關，且PNH克隆在移植后1個月內轉陰，但本研究病例較少，隨訪時間較短，仍需進一步研究證實。

總之，haplo-HSCT對于有移植指征的伴PNH克隆的SAA患者，可能具有一定的療效，但仍需關注GVHD、植入不良、血栓等并發癥，隨著移植技術的進步及補體抑制劑的應用，其移植療效將進一步改善。