利拉魯肽對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

來(lái) 靜，李 娜，李 超

(1.安康市中心醫(yī)院,陜西 安康 725000;2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,陜西 西安 710061)

急性肺損傷是一種以通透性肺水腫為典型臨床特征的綜合性疾病，是指因各種直接或間接致傷原因?qū)е碌姆闻萆掀ぜ?xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,患者常出現(xiàn)彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，發(fā)生急性低氧性呼吸功能不全[1-3]。其典型病理生理特征包括肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、通氣/血流比例失調(diào)等，臨床表現(xiàn)包括進(jìn)行性低氧血癥、呼吸窘迫等，影像學(xué)檢查可顯示為非均一性的滲出性病變，發(fā)展至嚴(yán)重階段可成為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratry distress syndrome，ARDS)[4-6]。急性肺損傷的病因較為復(fù)雜，流行病學(xué)調(diào)查顯示，2005年美國(guó)急性肺損傷的發(fā)病率達(dá)到了79/10萬(wàn)，嚴(yán)重感染患者急性肺損傷發(fā)生率約為25%～50%，多發(fā)性創(chuàng)傷發(fā)生率約為11%～25%，總體數(shù)據(jù)調(diào)研顯示急性肺損傷的病死率在15%～72%之間[7-8]。已有的研究[9-11]顯示，高糖狀態(tài)是急性肺損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高血糖不僅會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，同時(shí)還會(huì)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而通過(guò)改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，對(duì)改善因急性肺損傷引起的微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有積極意義。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽1(GLP-1)類似物[12]，已有的研究[13]指出，利拉魯肽能夠通過(guò)作用于PI3K信號(hào)通路來(lái)改善缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程，從而發(fā)揮一定的心肌保護(hù)作用。近些年還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)GLP-1受體在肺微血管等組織中也有表達(dá)[14-15]，這為急性肺損傷的治療提供了理論基礎(chǔ)。本研究通過(guò)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照實(shí)驗(yàn)的方式，探究利拉魯肽對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞生物進(jìn)程的影響,以期為急性肺損傷的治療提供新方向。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 選擇出生5～6 d的體重在10～15 g的SD大鼠(購(gòu)于北京清析技術(shù)研究院)，高糖DMEM(Thermo Fisher Scientific)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(Ausbian)，利拉魯肽(諾和諾德公司)，PISK/Akt阻斷劑LY294002(東蒼生物)，酶標(biāo)儀(Biotek)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離與培養(yǎng)：取大鼠左肺75%乙醇浸泡15 s，清洗后剪碎，Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶于37 ℃條件下各消化10 min，離心后重懸于培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除懸浮未貼壁細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞80%融合生長(zhǎng)后使用胰蛋白酶消化傳代，而后使用LPS 50 ng/ml刺激細(xì)胞生長(zhǎng)6 h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：在觀察最適合細(xì)胞生長(zhǎng)濃度時(shí)，分別設(shè)置0、1、10 、100 、1000 nmol/L五個(gè)濃度梯度的利拉魯肽干預(yù)組；在觀察利拉魯肽通過(guò)作用PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)、增殖遷移能力影響時(shí)區(qū)分為正常細(xì)胞組(0 nmol/L)、利拉魯肽組(100 nmol/L)和100 nmol/L利拉魯肽+10 μmol/L LY294002組。上述分組下藥物作用時(shí)間均為24 h。

1.2.3 MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：將細(xì)胞區(qū)分為五組后進(jìn)行正常培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后按照分組予以各組不同濃度利拉魯肽干預(yù)，每組細(xì)胞均接受藥物干預(yù)24 h，而后加入MTT溶液，酶標(biāo)儀570 nm下檢測(cè)光吸收值，計(jì)算每組吸光度平均值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 Western blot檢測(cè)Akt表達(dá)：三組細(xì)胞按照分組使用藥物干預(yù)結(jié)束后，提取總蛋白，選擇10%的SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行分離，分別使用PVDF洗膜、TBST洗膜后以β-actin作為內(nèi)參，使用Quantity One軟件采集信號(hào)后計(jì)算蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 Brdu檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：三組細(xì)胞使用藥物處理完畢后，加入含有Brdu的培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h，固定液固定20 min后封阻液封閉30 min，加入抗體液并培養(yǎng)30 min后加入熒光液，避光培養(yǎng)30 min，最后加入復(fù)染液，于熒光顯微鏡下計(jì)算各組的紅色熒光細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況：將1代細(xì)胞置于培養(yǎng)皿上，分別使用利拉魯肽和LY294002進(jìn)行處理后，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%開始實(shí)驗(yàn)，劃痕結(jié)束后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后顯微鏡下觀察各組細(xì)胞向劃痕其余區(qū)域遷移的距離(cm)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度利拉魯肽對(duì)細(xì)胞增殖能力影響 待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，將細(xì)胞進(jìn)行分組后分別使用0、1、10 、100、1000 nmol/L五個(gè)濃度梯度的利拉魯肽進(jìn)行干預(yù)，每24 h檢測(cè)一次A570值，MTT繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并開展組間差異性比較，結(jié)果顯示，在同一時(shí)間點(diǎn)上，A值會(huì)隨著利拉魯肽濃度的升高而顯著升高，在100 nmol/L時(shí)細(xì)胞達(dá)到最高促生長(zhǎng)濃度，優(yōu)于其他組別(均P<0.05)，繼續(xù)增加利拉魯肽濃度至1000 nmol/L并沒(méi)有增加細(xì)胞增殖能力，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度利拉魯肽對(duì)細(xì)胞增殖能力影響

2.2 利拉魯肽對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白影響 將細(xì)胞區(qū)分為正常細(xì)胞組(0 nmol/L)、利拉魯肽組(100 nmol/L)和利拉魯肽+LY294002組(100 nmol/L利拉魯肽+10 μmol/L LY294002),正常干預(yù)后使用Western blot法檢測(cè)p-Akt、Akt的表達(dá)情況，結(jié)果顯示同正常細(xì)胞組相比，利拉魯肽組細(xì)胞內(nèi)的Akt、p-Akt表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)，為進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/Akt信號(hào)通路在蛋白表達(dá)中的意義，使用通路阻斷劑LY294002進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中Akt、p-Akt表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 利拉魯肽對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白影響

2.3 利拉魯肽對(duì)細(xì)胞增殖能力影響 Brdu結(jié)果顯示，相比于正常細(xì)胞組，利拉魯肽組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖現(xiàn)象(P<0.05)，而應(yīng)用通路阻斷劑處理后，利拉魯肽+LY294002組細(xì)胞的增殖情況明顯較利拉魯肽組細(xì)胞出現(xiàn)降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 利拉魯肽對(duì)細(xì)胞增殖能力影響(%)

2.4 利拉魯肽對(duì)細(xì)胞遷移能力影響 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于正常細(xì)胞組，利拉魯肽的加入可以顯著促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞向劃痕空白區(qū)域的遷移生長(zhǎng)(P<0.05)，而加入通路阻斷劑進(jìn)行處理后，再次比較顯示利拉魯肽+LY294002組細(xì)胞相較利拉魯肽組細(xì)胞遷移能力顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 利拉魯肽對(duì)細(xì)胞遷移能力影響(cm)

3 討 論

微血管是指直徑在200 μm以下的血管，微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液和周圍組織之間開展物質(zhì)交換的主要屏障，同時(shí)微血管能夠合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，從而發(fā)揮抗炎、再生血管等重要功能，因而微血管的血液灌注對(duì)于組織正常功能的發(fā)揮起到重要作用[16-17]。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞是氣血屏障的重要組成部分，已有的研究[18-19]指出在多種肺相關(guān)炎癥、損傷等引起的病理進(jìn)程如急性肺損傷、ARDS中微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加是上述病理改變的中心環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的研究認(rèn)為急性肺損傷是由肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損所致，但對(duì)于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制等認(rèn)識(shí)不足，對(duì)其病理生理進(jìn)程尚不清楚[20]。近些年隨著分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步，關(guān)于急性肺損傷相關(guān)信號(hào)通路的研究不斷深入，多種信號(hào)通路在上述病理進(jìn)程中發(fā)揮的作用被逐漸揭示。

本研究通過(guò)開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方式，詳細(xì)論證了利拉魯肽對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞生物進(jìn)程的影響，并初步探究了PI3K/Akt信號(hào)通路在影響肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞生物進(jìn)程中所發(fā)揮的作用。研究結(jié)果顯示，利拉魯肽可以通過(guò)作用于PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移進(jìn)程，該結(jié)論通過(guò)應(yīng)用PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷劑LY294002得到了進(jìn)一步的印證，說(shuō)明了利拉魯肽對(duì)于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較明顯的干預(yù)效果。已有的研究[21]指出，細(xì)胞的遷移和增殖都會(huì)對(duì)血管再生和修復(fù)進(jìn)程產(chǎn)生明顯影響，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖能夠縮短血管再生進(jìn)程，加快受損血管的修復(fù)。GLP-1最早在糖尿病中發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)β細(xì)胞和胰腺小島內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，近些年GLP-1在心血管相關(guān)疾病的防治中發(fā)揮了重要作用，研究[22-23]證實(shí)GLP-1類似物諸如Exendin-4能夠通過(guò)激化PKA-PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，這種促增值作用也呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴性，在10 nmol/L濃度下作用24～48 h時(shí)增值作用最為明顯，這與文中100 nmol/L利拉魯肽干預(yù)下肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖最為明顯類似。

還有學(xué)者認(rèn)為在創(chuàng)傷性血管疾病修復(fù)進(jìn)程中，內(nèi)皮增殖、遷移是促進(jìn)再血管化的關(guān)鍵指標(biāo)，該學(xué)者通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)GLP-1可以通過(guò)受體依賴途徑促進(jìn)HUVECs細(xì)胞在劃痕實(shí)驗(yàn)中的遷移，但該學(xué)者未對(duì)其分子機(jī)制開展進(jìn)一步的論證研究[24]。本研究則通過(guò)設(shè)立不同組別的方式研究發(fā)現(xiàn)，同正常細(xì)胞組相比，利拉魯肽的加入明顯加快了肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖進(jìn)程，為驗(yàn)證該機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系，文中設(shè)立了利拉魯肽+PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷劑LY294002組，結(jié)果顯示加入信號(hào)通路阻斷劑后，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的遷移和增殖能力都出現(xiàn)了顯著的下降，這說(shuō)明了PI3K/Akt信號(hào)通路是影響實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖遷移的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。吳振華等[25]通過(guò)設(shè)立心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的方式，驗(yàn)證了利拉魯肽是通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt和MAPK/EPK信號(hào)通路，從而促進(jìn)原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移進(jìn)程，這印證了本研究結(jié)果的真實(shí)性。

綜上所述，利拉魯肽對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物進(jìn)程會(huì)產(chǎn)生顯著影響，分析其原因可能與利拉魯肽能夠作用于PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。