磷脂酰肌醇-3激酶和組蛋白去乙酰化酶雙靶點(diǎn)抑制劑CUDC-907對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞體內(nèi)、體外活性的影響

王月莉，董 曼

(銅川市人民醫(yī)院血液科，陜西 銅川 727100)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一種起源于血液系統(tǒng)造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，表現(xiàn)為干細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖、分化受阻、積聚，抑制機(jī)體正常造血功能，導(dǎo)致貧血、出血、淋巴結(jié)腫大等癥狀，病因多為基因突變、染色體異常等，且具有病死率高、預(yù)后不良等特點(diǎn)[1]。2009年我國(guó)腫瘤地區(qū)登記白血病發(fā)病率占全部惡性腫瘤發(fā)病的2.02%，病死率占全部惡性腫瘤死亡例數(shù)的2.40%[2]，每10萬(wàn)人中有3～5人患有該病，且呈逐年上升趨勢(shì)[3]。白血病一般分為四大類，分別是急、慢性髓系白血病(AML/CML)和急、慢性淋巴細(xì)胞白血病(ALL/CLL)，其中AML占急性白血病的80%以上[4]，若不進(jìn)行干預(yù)患者的生存期少于10個(gè)月，目前的治療方式一般為階段性化療和造血干細(xì)胞移植。研究[5-6]表明，約2/3老年人對(duì)化療耐受性差且并發(fā)癥多，長(zhǎng)期生存率不足50%。目前治療藥物多為小分子靶向抑制劑，如Bcl-2、FLT-3 等，但仍存在耐藥性問(wèn)題。因此，尋找治療AML的新靶點(diǎn)、新藥物是臨床研究的主要方向。PI3K/AKT 和 Ras/Raf/MEK/ERK 是研究較廣泛的腫瘤細(xì)胞活性相關(guān)的兩條通路，可通過(guò)下調(diào)Mcl-1且上調(diào)Bim抑制腫瘤細(xì)胞的活性[7]。本實(shí)驗(yàn)分別考察磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDAC)的共同抑制劑CUDC-907在體內(nèi)和體外兩種情況下作用于AML細(xì)胞時(shí)細(xì)胞活性的變化情況，為臨床開(kāi)發(fā)新的AML治療靶點(diǎn)、藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 急性髓系白血病AML細(xì)胞株Kasumi-1、HL-60及正常人骨髓細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，NSG-SGM3免疫缺陷小鼠(32只，雌雄各半，杰克森實(shí)驗(yàn)室)。胎牛血清(125 ml，美國(guó)Gibco公司)，CUDC-907試劑(5 mg，美國(guó)Selleck Chemicals公司)，Trizol試劑(100 ml，北京Solarbio科技有限公司)，Luciferase (10 mg/50 mg，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司)。實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)Q-PCR儀(QuantStudio 5，德國(guó)賽默飛公司)，高速離心機(jī)(TD-5M，山東博科科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Multiskan FC，德國(guó)賽默飛公司)，流式細(xì)胞儀(Cyto-FLEX，貝克曼庫(kù)爾特)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自德國(guó)賽默飛公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將急性髓系白血病AML細(xì)胞株Kasumi-1、HL-60及正常人骨髓細(xì)胞從液氮罐中取出，置于37 ℃水浴箱中解凍。完全融化后，吸取凍存液于含15%胎牛血清的培養(yǎng)液中，于37 ℃、含氧量95%、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)可開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄和Q-PCR擴(kuò)增 取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)的Kasumi-1、HL-60細(xì)胞株以及正常人骨髓細(xì)胞，鋪滿整個(gè)96孔培養(yǎng)板[(3～5)×103個(gè)/孔]，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔100 μl培養(yǎng)液，分別加入0、2 μmol/L的CUDC-907，將所有培養(yǎng)板分成五組，每組平行3孔，置于37 ℃、含氧量95%、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后每孔避光加人10 μl的熒光素底物L(fēng)ueiferin，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔懸液熒光強(qiáng)度。同時(shí)，另取上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染于24孔培養(yǎng)板上，加入上述濃度CUDC-907抑制劑，48 h后，用Trizol試劑提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,Mcl-1上游引物5’- CACGCCGAGTTCTCGATCGT-3’；下游引物 5’-CTACGGCATCCATGTATCCA-3’；Bim上游引物5’-GCTACCCTGATGTGAAGTCT-3’；下游引物5’-GCTCAGCATACGTCTAGCTG-3’；Q-PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)PI3K、HDAC表達(dá)水平的變化情況。

1.4 CUDC-907對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)的Kasumi-1、HL-60細(xì)胞株以及正常人骨髓細(xì)胞，鋪滿整個(gè)96孔培養(yǎng)板，加入0、2 μmol/L的CUDC-907，于48 h后收集細(xì)胞，Annexin V/PI染色法處理，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，記錄雙陰性細(xì)胞的比例。

1.5 AML小鼠模型的建立[8-9]選取8周齡NSG-SGM3免疫缺陷小鼠32只，雌雄各半，隨機(jī)分為兩組，16只/組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Kasumi-1，按照1∶5的劑量制成細(xì)胞懸液，每組小鼠經(jīng)尾靜脈注射Kasumi-1細(xì)胞懸液125 μl，建立AML小鼠模型。各組每天分別灌胃0、2 μmol/L的CUDC-907，每天觀察小鼠毛色、活動(dòng)情況、二便等狀況。

1.6 CUDC-907對(duì)AML小鼠體內(nèi)細(xì)胞活性的影響 待上述AML小鼠出現(xiàn)飲食不良、活動(dòng)受限、貧血等癌癥轉(zhuǎn)移癥狀時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理，收集小鼠骨髓細(xì)胞，測(cè)定小鼠細(xì)胞活性變化及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CUDC-907對(duì)體外AML細(xì)胞增殖的影響 采用Q-PCR法比較AML細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明，Kasumi-1和HL-60細(xì)胞株的熒光強(qiáng)度、Mcl-1表達(dá)量高于正常人骨髓細(xì)胞，Bim低于正常人骨髓細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；使用2 μmol/L CUDC-907與未使用CUDC-907相比能降低Kasumi-1、HL-60 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度、Mcl-1的表達(dá)水平，升高Bim表達(dá)水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 CUDC-907對(duì)體外AML細(xì)胞增殖的影響

2.2 CUDC-907對(duì)體外AML細(xì)胞凋亡的影響 采用Annexin V/PI雙染色法測(cè)定CUDC-907對(duì)Kasumi-1和HL-60細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，使用2 μmol/L CUDC-907處理AML細(xì)胞株Kasumi-1和HL-60與未使用CUDC-907相比雙陰性細(xì)胞比例明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 CUDC-907對(duì)體外AML細(xì)胞凋亡的影響(%)

2.3 CUDC-907對(duì)AML小鼠體內(nèi)骨髓細(xì)胞增殖的影響 采用Q-PCR法比較正常小鼠骨髓細(xì)胞、AML小鼠細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明，AML小鼠細(xì)胞熒光強(qiáng)度、Mcl-1表達(dá)量高于正常小鼠骨髓細(xì)胞，Bim低于正常小鼠骨髓細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；使用2 μmol/L CUDC-907與未使用CUDC-907相比能降低小鼠AML細(xì)胞的熒光強(qiáng)度、Mcl-1的表達(dá)水平，提升Bim表達(dá)水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 CUDC-907對(duì)AML小鼠體內(nèi)骨髓細(xì)胞增殖的影響

2.4 CUDC-907對(duì)AML小鼠體內(nèi)骨髓細(xì)胞凋亡的影響 采用Annexin V/PI雙染色法測(cè)定AML小鼠骨髓細(xì)胞在2 μmol/L CUDC-907下培養(yǎng)48 h后雙陰性細(xì)胞的比例發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明，2 μmol/L CUDC-907處理AML小鼠細(xì)胞與未使用CUDC-907組相比雙陰性細(xì)胞比例顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 CUDC-907對(duì)AML小鼠體內(nèi)骨髓細(xì)胞凋亡的影響(%)

3 討 論

AML約占成人白血病發(fā)病率的80%，是對(duì)人類健康威脅最為嚴(yán)重的惡性血液系統(tǒng)疾病。目前治療方式以化療為主，60%～80%患者可緩解病情，但復(fù)發(fā)率仍高達(dá)30%～40%，且多數(shù)化療藥物存在耐藥性機(jī)制治療效果并不理想。白血病治療藥物的耐藥性是多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果，主要涉及的耐藥機(jī)制有藥物外排、藥物解毒、細(xì)胞凋亡抵抗、DNA 損傷修復(fù)等多個(gè)方面[10]。PI3K/AKT 和Ras/Raf/MEK/ERK是目前為探索AML治療藥物研究較多的信號(hào)通路[11-13]，且PI3K和HDAC在多種癌組織中表達(dá)較高，CUDC-907作為PI3K和HDAC的雙抑制劑治療AML的具體作用機(jī)制有待研究，AML相關(guān)的小分子靶點(diǎn)如Bcl-2、FLT-3、Mcl-1和Bim[14-15]，在CUDC-907治療AML過(guò)程中扮演的角色以及是否存在耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)尚不清楚[16]。因此，本研究考察CUDC-907對(duì)體外、體內(nèi)AML細(xì)胞活性的影響及其作用機(jī)制，為尋找新的AML作用靶點(diǎn)、治療藥物延長(zhǎng)患者生命周期、提高存活率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

首先體外Q-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Kasumi-1和HL-60細(xì)胞與正常人骨髓細(xì)胞相比熒光強(qiáng)度、Mcl-1表達(dá)量明顯升高，而Bim的表達(dá)水平降低，提示兩種AML細(xì)胞株與正常人骨髓細(xì)胞相比增殖能力強(qiáng)、凋亡能力弱，表明Mcl-1、Bim是骨髓細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)鍵因子。2 μmol/L CUDC-907下培養(yǎng)Kasumi-1和HL-60細(xì)胞48 h后發(fā)現(xiàn)使用2 μmol/L CUDC-907與未使用CUDC-907相比能顯著降低Kasumi-1、HL-60 AML細(xì)胞的熒光強(qiáng)度、Mcl-1的表達(dá)水平，而使得Bim表達(dá)水平顯著升高。Ferro等[17]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路中，AKT可促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白Mcl-1發(fā)生轉(zhuǎn)錄，當(dāng)PI3K過(guò)表達(dá)時(shí)，促使Mcl-1上調(diào)從而抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)；Crysandt等[18]研究發(fā)現(xiàn)PI3K和HDAC抑制劑對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用與下調(diào)Mcl-1和上調(diào)Bim有關(guān)，說(shuō)明CUDC-907通過(guò)下調(diào)Mcl-1、上調(diào)Bim抑制Kasumi-1和HL-60細(xì)胞增殖。Annexin V/PI雙染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUDC-907作用于AML細(xì)胞使得AML雙陰性細(xì)胞的比例顯著降低，誘導(dǎo)AML細(xì)胞株凋亡。Stefan等[19]發(fā)現(xiàn)62%的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bim的表達(dá)水平低于正常細(xì)胞，HAT通過(guò)使CoA中的乙酰基發(fā)生轉(zhuǎn)移，DNA聚集促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，癌細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致HDAC過(guò)表達(dá)，使得組蛋白去乙酰化水平升高、促細(xì)胞凋亡因子Bim表達(dá)受到抑制。說(shuō)明CUDC-907誘導(dǎo)AML細(xì)胞(Kasumi-1和HL-60)的凋亡的作用與上調(diào)Bim明顯相關(guān)。

AML小鼠模型體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，AML能顯著降低AML小鼠骨髓細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，Mcl-1水平與對(duì)照組相比大幅降低，Bim水平較對(duì)照組提升，Annexin V/PI雙染色結(jié)果顯示AML小鼠細(xì)胞凋亡水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Courtney等[20]發(fā)現(xiàn)CUDC-907在胰腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中參與Ras/Raf/MEK/ERK下游因子Bim的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Katherine等[21]通過(guò)考察PI3K/AKT通路抑制劑對(duì)AML小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，該抑制劑在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，該研究結(jié)果從側(cè)面印證了體內(nèi)作用機(jī)制的準(zhǔn)確性。由此可見(jiàn)，CUDC-907對(duì)AML小鼠細(xì)胞增殖、凋亡的生理作用與體外情況一致，均能通過(guò)下調(diào)Mcl-1和上調(diào)Bim抑制AML細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，通過(guò)考察CUDC-907在體內(nèi)和體外條件下對(duì)AML細(xì)胞株Kasumi-1和HL-60增殖、凋亡的影響，結(jié)果表明CUDC-907對(duì)細(xì)胞的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用與PI3K/AKT 和Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路密切相關(guān)，其作用機(jī)制可能與抑制Mcl-1蛋白和促進(jìn)Bim表達(dá)有關(guān)。因此，PI3K和HDAC的雙抑制劑CUDC-907可用于臨床治療AML的藥物，其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。