分散液液微萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶飲料中黃曲霉毒素B1和B2

陳佩佩，陳琳珊，陳 茹

（1.廣東省食品工業公共實驗室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業研究所有限公司,廣東廣州 511442；3.廣東省質量監督食品檢驗站,廣東廣州 511442）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產生的一類次生代謝物[1]，從化學結構上，均屬于雙呋喃香豆素衍生物，是一類毒性極強的雙呋喃環類毒素。由于AFT產生菌在自然界中廣泛存在，很多的動植物源性食品都有可能存在污染[2]，尤其在植物的種植、加工、運輸、儲存等過程都有可能被產生菌污染，從而產生毒素[3]。同時，黃曲霉毒素在自然條件下穩定性較強，極性較低，難以用水或紫外線完全除去，只有在強堿性條件下容易分解[4]，過多的攝入引起致癌、致畸和致突變等毒性效應[5]，其中以黃曲霉毒素B1的毒性致癌性最強。近年來，我國黃曲霉毒素污染事件頻繁發生，因此，建立高效、通用、靈敏的相關檢測方法，對企業生產，消費者安全都有十分重要的意義。

目前，國內外對黃曲霉毒素的檢測方法主要有高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯質譜法[8-9]或液相色譜-高分辨質譜法[10]、免疫學檢測法[11-12]。高效液相色譜法操作煩瑣，盡管檢測器靈敏度高，但雜質多，分析時間較長，免疫學檢測法雖然能大批量檢測，但易與類似結構的化合物發生反應，出現假陽性，結果偏差較大。質譜法應用較廣，前處理簡單，定性定量能力好，但高分辨質譜價格昂貴，難以廣泛應用。本文以分散液液微萃取為前處理手段，建立了液相色譜-串聯質譜法對茶飲料中的黃曲霉毒素B1和B2進行測定。方法學驗證結果表明，方法整體方便快捷，靈敏度高，回收率好，可日常大批量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

API4000Q質譜儀、島津LC-20AD液相色譜系統、4k-15離心機、IKA Vortex4渦旋混勻器、Milli-Q Advantage A10超純水系統。

1.2 材料與試劑

茶飲料，廣州市售；黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2，純度大于98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸、乙腈、3-氯苯胺、三氯甲烷，均為HPLC級，美國Thermo Fisher公司；鹽酸、磷酸鈉，均為分析純，廣州試劑廠；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.3 樣品前處理

于15 mL尖底離心管中加入1 mL 2 mol/L的鹽酸溶液和50 μL 3-氯苯胺充分混勻，然后加入5 mL樣品，渦旋提取10 min，使用1 mol/L的磷酸鈉溶液調節pH至6，渦旋混勻后置于離心機中以4 500 r/min離心5 min，使3-氯苯胺沉淀。除去上層水相，下層3-氯苯胺用乙腈定容至200 μL，待測定。

1.4 標準曲線的繪制

標準儲備溶液：分別準確稱取黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2標準品各0.050 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用乙腈稀釋成500 mg/L的儲備液。

標準中間溶液：用乙腈將上述儲備液稀釋成濃度為10 mg/L的標準中間液。

溶劑曲線：使用乙腈配制成1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L 和 100 μg/L 的標準使用液，繪制校準曲線。

基質曲線：使用空白烏龍茶基質液配制校準曲線，濃度點與溶劑曲線相同。

1.5 色譜及質譜條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Xbridge BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）；進樣體積：10 μL；流速0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；等度洗脫程序：0.0～5.0 min，75% A。

1.5.2 質譜條件

離子源：ESI源；離子化模式：電噴霧電離源正模式（ESI+）；氣簾氣壓：241 kPa；毛細管電壓：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；霧化氣壓力：345 kPa；加熱輔助氣壓力：345 kPa；碰撞氣（CAD）：中等；采集模式：多反應監測（MRM）模式。

2 結果與分析

2.1 定性定量分析依據的收集

根據黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的化學結構，其含有較多含O基團，在離子化過程中傾向于得到質子，因此分別以其相對分子質量加上H+質量，初步確定母離子質荷比。以混合流動相的流動注射的方式向離子源注射標準溶液，在m/z313.1和m/z315.1處，均得到較高響應的[M+H]+離子，同時以多反應監測（MRM）模式采集二級碎片。進一步優化去簇電壓DP和碰撞電壓CE，得到較優響應，二級質譜圖見圖1，詳細質譜信息見表1。

表1 黃曲霉毒素B1、B2質譜數據

圖1 黃曲霉毒素的二級質譜圖

2.2 分散劑的選擇

分散液液微萃取過程中，加入分散劑和待測樣液互溶，加入萃取劑振蕩形成微小的液滴，這些液滴在移動的過程中于對目標物進行連續萃取，形成水/分散劑/萃取劑形成均相乳濁液體系，快速完成分析物在水溶液與萃取劑之間的分配平衡。選擇鹽酸作為分散劑。在本實驗中，當分散劑用量小于0.6 mL時，提取回收率低于70%，使用量為1.0 mL時，回收率達到最高，隨著使用量提高至1.2 mL，回收率有所回降。所以鹽酸分散劑用量選取為1.0 mL。詳細結果見圖2。

圖2 分散劑體積對回收率的影響

2.3 萃取劑體積的選擇

在分散劑體積為1 mL的條件下，分別用30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、110 μL和130 μL的3-氯苯胺進行萃取，考察了不同體積的萃取劑對萃取回收率的影響，結果如圖3所示。隨著3-氯苯胺體積增大，回收率也增大，而當體積大于50 μL時，回收率增大不明顯，而且3-氯苯胺的使用體積越大，pH回調的幅度也越大，實驗更耗時，最終定容液3-氯苯胺的占比也越大，對于含有甲酸的流動相體系，容易造成溶劑效應，使峰型變差。因此，最終確定3-氯苯胺50 μL為最佳萃取體積。

圖3 萃取劑體積對回收率的影響

2.4 基質效應的探討

市售的茶飲料會添加糖、色素、酸度調節劑或其他添加劑，且含量遠超于黃曲霉毒素可能存在的含量，加上茶葉本身含有較多的天然物，因此有可能造成較嚴重的基質效應（ME），使定量結果偏差較大。為了探究實驗實際存在的基質效應，分別用空白基質液和乙腈配制了基質曲線和純溶劑曲線，并以基質曲線和純溶劑曲線的斜率比ME值為判斷依據，當ME在80%～120%時，則說明基質效應不明顯。實驗結果顯示，黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的ME值分別為23.2%和26.5%，說明基質負效應明顯，因此最終選擇使用基質曲線進行定量，以校正基質效應造成的偏差。

2.5 定量分析結果

使用空白基質溶液配制標準曲線，線性范圍為1.0～100 μg/L，將該曲線于優化后的條件下測定，以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。同時以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10分別確定方法的檢測限與定量限。黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2定量離子流圖見圖4。

圖4 黃曲霉毒素提取離子流色譜圖

結果表明，黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的相關系數r分別為0.999 6和0.999 3，基質曲線方程分別為Y=5 050X+2 240和Y=3 090X+2 750，檢測限均為20.0 ng/kg，定量限均為50.0 ng/kg。由分析結果可知，本方法定量能力好，檢出限低，可有效對茶飲料中的黃曲霉毒素進行定量分析。

2.6 回收率及精密度分析

分別對市售的3種茶飲料（綠茶、烏龍茶、紅茶）進行測定，結果均為陰性。使用該樣品進行加標回收實驗。每種樣品均按照定量限的1倍、2倍和10倍進行添加，即0.05 μg/kg、0.10 μg/kg、0.50 μg/kg濃度水平，每個濃度水平在日內平均測定6次，平均回收率和相對標準偏差結果見表2。

表2 加標回收率及相對標準偏差數據（n=6）

3種樣品的平均回收率范圍在71.2%～91.0%，RSD范圍在2.23%～6.43%，方法回收率、精密度及準確度良好，可用于實際樣品的測定。

3 結論

以液液微萃取為基礎，建立前處理方法，方法整體高效簡單，通過調節pH，較大限度回收萃取劑，提高了回收率；建立UPLC-MS/MS法，優化了色譜及質譜條件，兩種黃曲霉毒素在樣3 min內出峰，且峰型良好。使用基質曲線對定量結果進行校準，降低了基質效應對結果的影響。回收率和相對標準偏差數據表明，方法靈敏度高、重現性好，可為茶飲料中毒素測定方法的開發提供依據。