高效液相色譜法測定肉制品中胭脂紅的不確定度評定

周秀娟

（貴州省檢測技術研究應用中心，貴州貴陽 550014）

胭脂紅，又名食用赤色102號，為水溶性偶氮類人工合成著色劑。作為食品色素，胭脂紅可用于果汁飲料、配制酒、碳酸飲料和糖果等食品的著色，而肉干、肉脯制品、水產品等食品中是不允許添加的，但胭脂紅在食品中過量添加或違規添加的食品安全事件時有發生，嚴重威脅著消費者的身體健康與安全。本文參考國家標準《肉制品 胭脂紅著色劑測定》（GB/T 9695.6—2008）[1]HPLC法，對肉制品中胭脂紅測定結果的不確定度進行評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市場購買腌臘肉。胭脂紅標準品（濃度為0.5 mg/mL，中國計量科學研究院）、水（二級水）、甲醇（色譜純）、甲酸、石油醚、無水乙醇、鎢酸鈉、檸檬酸和乙酸銨。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）、色譜柱、精密天平、恒溫水浴鍋、聚酰胺小柱和超聲波清洗機。

1.3 分析方法

整個檢測過程均在（20±5）℃環境條件下進行。

1.3.1 前處理過程

采用萬分之一天平稱取5.0 g肉制品樣品，置于50 mL離心管中，加30 mL石油醚，攪拌、靜置，棄去石油醚，去除脂肪。加無水乙醇+氨水+水，溶液提取胭脂紅，收集提取液于250 mL錐形瓶中，70 ℃水浴濃縮至約10 mL，加入1 mL硫酸溶液和1 mL鎢酸鈉溶液，混勻，繼續70 ℃水浴5 min，取上清液全部過聚酰胺小柱，用約15 mL甲醇-甲酸水淋洗，最后用15 mL無水乙醇+氨水+水洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，用水定容至10 mL，經0.45 μm濾膜過濾，用高校液相色譜檢測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇和0.02 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長508 nm；進樣量20 μL。

1.3.3 標準溶液的配制過程

（1）50 μg/mL標準溶液的配制。用1 mL的分度吸量管流出式（A級）從0.5 mg/mL的標準儲備液中移取1 mL于10 mL的單標線容量瓶（A級）中，用水定容至刻度。

（2）配制標準系列溶液，濃度分別為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL 和 8.0 μg/mL。①8.0 μg/mL標準溶液配制。用1 mL分度吸量管從50 μg/mL的標準儲備液中移取0.8 mL于5 mL容量瓶中，用水定容。②5.0 μg/mL標準溶液配制。用1 mL分度吸量管從50 μg/mL的標準儲備液中移取1 mL于10 mL 容量瓶中，用水定容。③ 0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL 標 準 溶 液 配 制。 用 1 mL 分 度 吸量管從5 μg/mL標準溶液中分別移取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL于4個1 mL容量瓶中，用水定容。

1.3.4 重復測定與加標回收率

按照1.3中前處理方法和色譜條件。取一陽性樣品，在重復性條件測定6次，取平均值為最終檢測結果；采用陰性樣品添加濃度為3 μg/mL進行回收率試驗，測定6次計算其回收率。

2 數學模型

試樣中胭脂紅含量的數學模型為：

式（1）中，x-試樣中胭脂紅的含量，單位mg/kg；c-從標準工作曲線計算得到的試樣溶液中胭脂紅的濃度，單位μg/mL；v-待測樣液最終定容體積，單位mL；m-待測樣品質量，單位g；-加標回收率校正因子。

3 不確定度來源分析

從測定過程和數學模型分析，胭脂紅含量測定的不確定度來源有：①標準溶液引入的不確定度urel(c)；②樣品稱樣量引入的不確定度urel(m)；③樣品最終定容體積引入的不確定度urel(v)；④樣品前處理過程產生的不確定度urel(x)；⑤測量回收率校正因子引入的不確定度urel(R)[2]。

4 不確定度的評定

4.1 標準溶液引入的不確定度

標準溶液引入的不確定度分為標準溶液定值、標準儲備液的稀釋、標準工作曲線的配制和標準曲線擬合4個部分。

（1）標準溶液定值引入的相對標準不確定度urel(c1)。由標準物質證書提供信息得知，標液濃度為0.5 mg/mL，其相對擴展不確定度為2%（k=2），即相對標準不確定度

（2）稀釋得到50 μg/mL標準儲備液引入的相對不確定度urel(c2)。該不確定度包括定容時容器的容量和環境溫度變化兩方面引入的不確定度。按照《常用玻璃量器檢定規程》（JJF 196—2006）[3]規定的容量允許誤差，定容時玻璃器具容量誤差見表1，因溫度變化產生的誤差見表2。按三角分布，即

表1 容量誤差

表2 溫度變化誤差

定容過程中，實驗室環境溫度波動為±5 ℃。20 ℃時，水的膨脹系數2.1×10-4℃，玻璃的膨脹系數為1.5×10-5℃，則：

式中：α水-水的膨脹系數，α玻璃-玻璃的膨脹系數，v20-20 ℃時誰的體積，T溫度，Δv-水的體積差。

（3）標準工作曲線配制產生的相對標準不確定度urel(c3)。根據1.3.3配制過程中使用的一系列玻璃量具，其產生相對標準不確定度分量見表3和表4。

表3 容量誤差

表4 溫度變化誤差

由容量誤差引入的合成相對不確定度

因環境溫度變化引入的合成相對不確定度

標準工作曲線配制產生的相對標準不確定度

（4）標準曲線擬合產生不確定度[4]urel(c4)。用最小二乘法擬合標準溶液質量濃度-峰面積曲線，分別測定6種質量濃度的胭脂紅標準液 0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL和8.0 μg/mL，每種質量濃度測定2次，得到相應的峰面積A測定結果見表5。

表5 最小二乘法擬合標準工作曲線結果

重復測定樣品6次，將其峰面積代入線性回歸方程計算測定濃度，再根據公式（1）計算待測物含量，其由標準工作曲線擬合所引入的標準不確定度為urel(c4)。

峰面積測量的標準偏差s為：

標準溶液引入的相對不確定度

4.2 樣品的稱量產生的不確定度urel(m)

根據JJG 1036—2008，其最大允許誤差±1 mg，則標準不確定度稱樣質量為5.001 2 g，其相對標準不確定度

4.3 樣品的最終定容體積產生的不確定度urel(v)

根據1.3.1中前處理方法，最終定容體積為10 mL，產生不確定度如下。

其相對標準不確定度為

（2）環境溫度變化引起溶劑體積變化，玻璃容量瓶體積的變化。

Δv=v1-v20=(a水-a玻璃)×v×(T1-T2)，則相對標準不確定度

4.4 樣品前處理過程產生的不確定度通過重復性檢測評定urel(x)

該不確定度為A類不確定度，按照1.3的分析方法對同一樣品重復測定6次，測定結果見表6。

表6 重復性條件測試結果

4.5 加標回收率產生的相對標準不確定度urel(R)

按照1.3.1的前處理方法進行加標回收測定，回收率（R）測定結果見表7，該不確定度為A類不確定度。

回收率R/（%）平均回收率R/（%）1 0 6.0 1 0 5.0 9 8.8 1 0 3.0 9 9.5 1 0 4.0 1 0 3.0

為了確定回收率是否計入研制和含量的計算中，將回收率進行顯著性t檢驗，說明與1.0無顯著性差異，則計算中不需采用回收率校正因子對結果進行修正，回收率產生的相對標準不確定度不應納入合成不確定度的計算[5]。

4.6 擴展不確定度評定和測定結果表示

5 結論

從對肉制品中胭脂紅測量不確定度的分析可看出，每一步操作都會產生測量不確定度，其中標準溶液、樣品重復性測量、加標回收引入的不確定度較大。標液的配制、稀釋、標線的配制過程中，過程越復雜、使用器具越多，最后產生的不確定度越大。樣品重復性測量產生不確定較大，可以通過關注固相萃取柱的回收率、提高樣品的均勻性及人員的操作技能減小測量結果的不確定度。