血漿p16、ANXA-1抗體在非小細胞肺癌患者的表達變化及其作為診斷標志物的探討

趙 歡 張 萱 韓志峰 馬小莉（青島大學附屬青島市立醫院內分泌科，青島266071）

哺乳動物細胞周期的順利進行得益于細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）及細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制蛋白（cyclin-dependent protein kinase inhibitors，CKIs）的協同作用及平衡調節，細胞周期中設有多個調控點以保障其順利有序進行，其中，G1-S期是最為關鍵的調控點。正常生理情況下，細胞分化增殖過程中，CyclinD1與CDK4、CDK6相互作用形成復合物，促進Rb蛋白磷酸化失活及轉錄因子E2F1釋放入核。進入細胞核的E2F1與靶基因啟動子結合促進S期相關基因轉錄，細胞由G1期進入S期。p16蛋白是G1晚期的負性調控因子，通過與CyclinD1蛋白競爭性結合CDK4及CDK6抑制CDK4∕6介導的Rb蛋白磷酸化，導致細胞周期停滯于G1期［1-2］。CyclinDl∕p16∕Rb信號傳導通路的任一環節異常都可能導致細胞周期紊亂，導致腫瘤發生。與多數正常組織微量表達或幾乎不表達不同，多個文獻報道了多種實體腫瘤內p16蛋白過度表達，且與腫瘤發生及其惡性生物學行為有關［3］。

膜聯蛋白A1（Annexin A1，ANXA-1）是鈣離子依賴性磷脂結合蛋白超家族成員，在調控炎癥反應、細胞增殖和分化、凋亡細胞吞噬清除等過程中發揮重要作用［4］。研究發現，ANXA-1在COPD及NSCLC中 表 達 上 調［5］。ANXA-1可 通 過ANXA-1∕NF-κB∕miR-26a信號通路增強NSCLC細胞中核因子NF-κB活 化，促 進 腫 瘤 侵 襲 與 轉 移［6］。敲 除ANXA-1基因可抑制NSCLC細胞增殖，遷移和侵襲［4］。表明ANXA-1可能在NSCLC發生、進展中發揮重要作用［7］。

腫瘤發生早期，異常表達的腫瘤抗原可被機體免疫系統識別，激活體液免疫應答，導致相應抗體產生，稱為腫瘤相關自身抗體（tumor associated autoantibody，TAAb）［8-9］。部分TAAb在臨床癥狀出現前即可在患者血液中檢測到，為尋找潛在腫瘤早期診斷標志物提供依據。目前已在多種腫瘤細胞中檢測到p16、ANXA-1自身抗體，如肝細胞癌、乳腺癌、食管癌、宮頸癌［10-13］。NSCLC患者血漿中也檢測到p16、ANXA-1抗體，但p16、ANXA-1自身抗體能否作為肺癌診斷的腫瘤標志物尚未明確。本研究采用抗原表位預測工具設計、合成抗原多肽（p16a、p16b、ANXA-1），采用自行建立的優化ELISA法檢測NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達情況，分析其表達與臨床病理特征的關系及其對NSCLC的診斷價值，以期為NSCLC診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2014年11月至2018年8月于吉林大學中日聯誼醫院胸外科首次確診的NSCLC患者209例，男性131例，女性78例，年齡33～79歲，平均年齡58歲。根據2009年國際抗癌聯盟UICC肺癌TNM分期標準，Ⅰ期20例，Ⅱ期100例，Ⅲ期40例，Ⅳ期49例。所有患者未接受過抗腫瘤治療（放化療或手術治療），且所有患者均經手術切除肺組織病理學檢查確診。排除有惡性腫瘤家族史或合并其他腫瘤及患有自身免疫性疾病者。同時，選取同期健康志愿者193例作為正常對照組，男性103例，女性90例，年齡33～79歲，平均年齡58歲。根據病例資料，統計NSCLC組人口學信息，如年齡、性別、吸煙狀況，及臨床分期、病理類型、分化程度、腫瘤大小、是否有淋巴結轉移等病理學信息。本研究經青島大學附屬青島市立醫院倫理委員會批準，所有受試者知情同意。

1.1.2 主要試劑 抗原肽委托上海吉爾生化有限公司合成；96孔酶標板購自美國Thermo Fisher Scientific公司；1.0 mol∕L磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖片、小牛血清白蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體購自英國Abcam公司；顯色劑、終止液購自美國Life Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 清晨、空腹狀態下采集靜脈血5 ml，4℃、2 500 r∕min離心10 min，收集上層血漿進行檢測，剩余血漿于-80℃保存。

1.2.2 抗原肽設計、合成 采用生物信息學數據庫及表位預測軟件（http：∕∕www.iedb.org）設計抗原肽：對目標蛋白p16、ANXA-1進行序列分析，評估其pH值、親水性、柔性、抗原性、表面可及性等，根據每段序列與HLA-Ⅱ51個等位基因分子的結合力篩選目標分子結構中潛在的T細胞表位，預測每段序列潛在的B細胞表位，評分，對滿足上述要求的抗原片段進行綜合評估，并根據抗原設計的一般原則對抗原片段進行適當調整，如N段親水性氨基酸的添加以增加片段親水性等，最終設計并委托上海吉爾生化公司合成3條抗原肽，分別為p16a、p16b、ANXA-1，p16a、p16b來源于p16蛋白，其分子結構中包含不同B細胞表位，3條抗原肽序列信息見表1。

表1 抗原肽序列信息Tab.1 Sequences information of antigen peptides

1.2.3 ELISA法檢測p16、ANXA-1抗體 將抗原肽稀釋至工作濃度（20 μg∕ml），100 μl∕每孔，4℃孵育過夜，0.1%PBST洗板3次，200 μl∕孔加入半胱氨酸溶液（10 μg∕ml）室溫避光封閉1 h，洗板2次后放入40℃烘箱干燥2.5 h，4℃放置1周，按照課題組前期方法進行抗體檢測［14-15］。0.1%PBST洗板2次，0.5%小牛血清白蛋白（BSA）1：100稀釋后每孔加入50 μl，室溫孵育1.5 h，洗板3次，加入用0.5%BSA 1∶25 000稀釋的過氧化物酶標記的IgG二抗50 μl，室溫孵育1 h。50 μl∕孔加入顯色劑，室溫避光反應25 min，加入25 μl終止液終止反應，15 min內采用自動酶標儀檢測450 nm標準波長和620 nm參考波長處吸光度（OD）。每板均設空白對照、陽性對照。所有樣本設復孔，以2孔測定值的平均值表示該樣本OD值。所有樣本重復測定2次，以2次OD值的平均值進行數據分析。以特異性結合指數（SBR）表示血漿p16、ANXA-1抗體水平，SBR=（OD樣本-OD陰性對照）∕（OD陽性對照-OD陰性對照）。

1.3 統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗對計量資料進行正態性檢驗，NSCLC組及健康對照組血漿p16、ANXA-1抗體水平及不同TNM分期NSCLC患者抗體表達水平均呈正態分布，以±s表示，組間比較采用Student′st檢驗。不同TNM分期NSCLC組抗體表達水平兩兩比較采用LSD檢驗。NSCLC組及健康對照組性別、吸煙情況等比較采用χ2檢驗。采用Graphpad prism 5.0軟件繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并分析p16、ANXA-1抗體對NSCLC的診斷價值，計算最佳截斷值、靈敏度及特異度。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組及健康對照組臨床資料比較NSCLC組包括腺癌124例，鱗癌85例（圖1）；如表2所示，TNM分期Ⅰ期20例，Ⅱ期100例，Ⅲ期40例，Ⅳ期49例。NSCLC組與健康對照組的性別、年齡、吸煙情況差異無統計學意義。

圖1 NSCLC患者病理及免疫組化特征（HE染色，×40）Fig.1 Pathological and immunohistochemical features of NSCLC patients（HE staining，×40）

表2 NSCLC組及對照組臨床資料比較［±s，例（%）］Tab.2 Comparison of clinical characteristics between NSCLC group and control group［±s，n（%）］

表2 NSCLC組及對照組臨床資料比較［±s，例（%）］Tab.2 Comparison of clinical characteristics between NSCLC group and control group［±s，n（%）］

Note：SCC.Squamous cell carcinoma；AC.Adenocarcinoma.

Variables Age（year）Gender Male Female Smoking history No Yes Histology SCC AC TNMⅠⅡⅢⅣNSCLC 58.6±8.7 131（62.7）78（37.3）103（49.3）106（50.7）85（40.7）124（59.3）20（9.6）100（47.8）40（19.1）49（23.5）Control 58.6±9.3 103（53.4）90（46.6）93（48.2）100（51.8）N∕A N∕A N∕A N∕A N∕A N∕A χ2∕t-0.06 3.58 0.05 P 0.96 0.06 0.83

2.2 多組間血漿p16、ANXA-1抗體表達水平比較 如表3所示，NSCLC組血漿p16a抗體表達水平顯著高于健康對照組（P＜0.001），且NSCLC患者早期（Ⅰ期）即出現p16a抗體表達增加，隨肺癌進展，其表達水平逐漸升高。NSCLC患者血漿ANXA-1抗體表達較健康對照組顯著增加，且在Ⅱ～Ⅳ期患者中增加更為顯著（P＜0.05）。NSCLC組與健康對照組p16b抗體表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。不同TNM分期患者血漿p16、ANXA-1抗體表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組血漿p16、ANXA-1抗體表達水平比較（±s）Tab.3 Comparison of expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 in different groups（±s）

表3 各組血漿p16、ANXA-1抗體表達水平比較（±s）Tab.3 Comparison of expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 in different groups（±s）

Note：1）P＜0.05，2）P＜0.001 vs Control group.

Groups Control NSCLCⅠⅡⅢⅣn 193 209 20 100 40 49 p16a IgG 0.53±0.17 0.75±0.182）0.69±0.232）0.73±0.182）0.77±0.142）0.78±0.182）p16b IgG 0.87±0.26 0.89±0.31 0.85±0.41 0.86±0.23 0.93±0.30 0.93±0.41 ANXA-1 IgG 1.01±0.48 1.17±0.482）1.17±0.60 1.16±0.501）1.17±0.431）1.20±0.441）

2.3 NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達與臨床病理特征相關性分析 如表4所示，鱗癌患者血漿p16a抗體表達水平顯著高于腺癌患者（P=0.02）。高分化患者血漿p16a抗體表達水平顯著低于低分化患者（P=0.03）。伴有淋巴結轉移的NSCLC患者血漿p16a、p16b抗體表達水平顯著高于無淋巴結轉移者（P=0.03，P=0.03）。p16a抗體表達與病理類型、分化程度、淋巴結轉移相關，p16b抗體表達水平僅與淋巴結轉移有關。NSCLC患者血漿ANXA-1抗體表達與年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期均無關（P＞0.05）。

表4 NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達與臨床病理特征相關性（±s，n=209）Tab.4 Relationship between expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 and clinicopathological parame?ters of NSCLC patients（±s，n=209）

表4 NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達與臨床病理特征相關性（±s，n=209）Tab.4 Relationship between expression levels of auto-antibodies against p16 and ANXA-1 and clinicopathological parame?ters of NSCLC patients（±s，n=209）

Note：SCC.Squamous cell carcinoma；AC.Adenocarcinoma.

Variables Gender Male Female Age（year）≥60＜60 Smoking history Yes No Histology SCC AC Differentiation grade Well∕Moderate Poor pT 1～2 3～4 N Present Absent TNMⅠ～ⅡⅢ～Ⅳn 131 78 104 105 98 111 85 124 102 107 205 4 102 107 120 89 p16a IgG 0.77±0.16 0.72±0.20 0.77±0.17 0.73±0.19 0.76±0.18 0.73±0.17 0.78±0.17 0.72±0.18 0.72±0.18 0.77±0.17 0.75±0.18 0.73±0.17 0.77±0.16 0.72±0.19 0.73±0.19 0.77±0.16 t 1.96-1.56-1.78-2.31 2.23 0.16-2.13-1.91 P 0.05 0.12 0.09 0.02 0.03 0.87 0.03 0.06 p16b IgG 0.89±0.29 0.89±0.36 0.92±0.35 0.86±0.27 0.90±0.31 0.88±0.25 0.91±0.33 0.87±0.30 0.87±0.29 0.91±0.33 0.89±0.31 1.00±0.49 0.94±0.35 0.84±0.26 0.86±0.27 0.93±0.36 t 0.34-1.43-1.03-0.84 0.99 0.71-2.26-1.75 P 0.74 0.16 0.23 0.40 0.32 0.48 0.03 0.08 ANXA-1 IgG 1.21±0.47 1.10±0.51 1.22±0.44 1.12±0.52 1.16±0.34 1.13±0.46 1.19±0.44 1.15±0.51 1.12±0.45 1.22±0.51 1.17±0.48 1.20±0.62 1.22±0.46 1.13±0.50 1.16±0.52 1.19±0.43 t 1.66-1.37-1.19-0.59 1.43-0.14-1.37-0.39 P 0.10 0.17 0.32 0.55 0.16 0.89 0.17 0.70

2.4 血漿p16抗體和ANXA-1抗體對NSCLC的診斷價值 采用ROC曲線評價血漿p16抗體和ANXA-1抗體對NSCLC的診斷價值，結果如圖2、表5所示，p16a抗體AUC為0.816（95%CI：0.774～0.857），截斷值為0.61，診斷靈敏度為78%，特異度為75%。p16a抗體對Ⅰ期患者診斷的AUC為0.701（95%CI：0.575～0.828），診 斷 靈 敏 度 為55%，特異度為81%，提示p16a抗體對早期NSCLC有輔助診斷價值。p16a抗體對Ⅱ～Ⅳ期的診斷效能稍高于Ⅰ期，AUC分別為0.805、0.869、0.843，診斷靈敏度分別為77%、90%、74%，特異度分別為75%、75%、83%。ANXA-1抗 體AUC為0.614（95%CI：0.559～0.669），截斷值為1.04，診斷靈敏度為57%，特異度為67%。p16b抗體AUC為0.502（95%CI：0.446～0.559），對NSCLC的診斷效能較差。

圖2 血漿p16、ANXA-1抗體診斷不同分期NSCLC的ROC曲線圖Fig.2 ROC curve of diagnostic value of p16 and ANXA-1 antibodies for different stages of NSCLC

表5 p16、ANXA-1抗體對不同分期NSCLC診斷效能的ROC曲線分析（%）Tab.5 ROC curve analysis of diagnostic efficacy of circu?lating antibodies against p16 and ANXA-1 in dif?ferent stages of NSCLC（%）

3 討論

作為機體抗腫瘤免疫應答產物，雖然腫瘤相關自身抗體產生的機制尚未闡明，但大量研究表明其可能與腫瘤發生、發展及預后密切相關。QIU等［16］通過檢測肺癌診斷1年前患者血清中LAMR1自身抗體水平發現，其表達較對照組顯著升高，且越接近疾病診斷時升高趨勢越為明顯。課題組前期研究發現，survivin抗體表達水平較高的NSCLC患者術后生存期較表達水平較低組顯著延長，為從眾多腫瘤相關自身抗體中尋找可用于NSCLC早期診斷或預后的生物標志物奠定了基礎［15］。作為腫瘤標志物，自身抗體具有以下優點：結構穩定、不易被蛋白酶水解、可在血清穩定存在較長時間（半衰期7～30 d），并經過免疫放大效應，即使在腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAAs）濃度較低時仍可以高水平存在［17-18］。使自身抗體與其相應的TAAs相比在作為癌癥早期診斷生物標志物上更有優勢。

作為細胞生長、增殖的負性調節基因，p16在多種實體腫瘤中過表達，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和食管鱗狀細胞癌等［19-22］。p16異常表達通常發生在腫瘤早期，為探索p16抗體作為腫瘤早期診斷標志物的價值提供了有力依據。研究發現，p16抗體對早期食管癌、宮頸癌有一定診斷價值［12，23］，但p16抗體對NSCLC早期診斷價值的研究結論尚未統一。ANXA-1分子具有抗炎活性，可通過抑制免疫細胞聚集、遷移及活性削弱機體免疫監視功能，從而促進腫瘤發生、進展。研究報道ANXA-1在COPD及NSCLC中表達上調。因此，本研究推測ANXA-1抗體可預測NSCLC發生。檢測NSCLC患者血漿p16、ANXA-1抗體表達情況發現，NSCLC患者血漿p16a、ANXA-1抗體表達水平顯著高于健康對照組，且隨肺癌進展，兩者表達呈逐漸增高趨勢，推測p16a、ANXA-1抗體可能參與NSCLC發生發展。NSCLC患者血漿p16a抗體過表達的機制尚未闡明，但大量證據表明p16a抗體過表達可能與p16Ink4a-Rb通路異常有關。Rb蛋白可負反饋調節p16基因表達，腫瘤發生通常伴隨Rb蛋白表達缺失，導致p16基因過表達。p16基因過表達可能是機體抗腫瘤的方式，機體試圖通過抑制腫瘤細胞增殖抑制肺癌進展，但效果較差［24］。p16a、ANXA-1抗體在NSCLC患者血漿的表達有明顯差異，ANXA-1抗體在Ⅱ～Ⅳ期而非Ⅰ期患者中表達增加，提示ANXA-1可能主要在NSCLC中晚期而非早期發揮作用。ANXA-1對NSCLC預后的影響及分子機制目前鮮有報道，仍需大規模回顧性研究進一步闡明。p16a在Ⅰ期NSCLC患者中表達增加，提示p16a可能參與NSCLC發生，有望成為NSCLC早期診斷的生物標志物。采用ROC曲線分析p16、ANXA-1抗體對不同TNM分期診斷價值發現，p16a抗體診斷Ⅰ期NSCLC患者的AUC為0.701，敏感度為81%，提示其對早期肺癌有一定診斷價值；低分化、伴有淋巴結轉移的NSCLC患者血漿p16a抗體表達水平顯著高于高分化、無淋巴結轉移患者，提示p16a抗體可能對NSCLC預后有一定預測價值，且p16a抗體對Ⅱ～Ⅳ期NSCLC的診斷效能優于Ⅰ期，因此，p16a有望成為NSCLC分期預測及預后評估的生物標志物。另外，p16a抗體的表達模式可能具有腫瘤特異性。JIN等［12］發現隨食管癌進展，p16a抗體表達逐漸減弱，與p16a抗體在NSCLC中的表達趨勢相反。由于p16在多種實體腫瘤中均存在表達異常，仍需進一步探索p16a抗體在其他實體腫瘤中的表達變化，以明確p16抗體對NSCLC的診斷是否具有特異性。本研究為病例對照研究，Ⅰ期患者樣本量相對較小，故研究結論存在一定局限性；此外，p16a、ANXA-1抗體參與NSCLC發生發展的分子機制仍需進一步研究。

與重組蛋白相比，線性抗原肽具有非特異性結合少、表位特異性強等優勢，且造價低廉、檢測技術成熟、操作簡便，適用于肺癌高危人群篩查。本研究根據p16分子中2個不同抗原表位分別設計了p16a和p16b 2個抗原肽，通過檢測NSCLC患者血漿p16a、p16b抗體表達水平發現，兩者在NSCLC血漿的表達趨勢截然不同：p16a抗體在NSCLC組表達顯著高于健康對照組，而p16b抗體表達與健康對照組統計學差異無統計學意義。不同抗原表位的免疫原性不同，與MHC分子結合后激活B細胞產生抗體的能力也不同［25］。p16a抗原肽所含的抗原表位是觸發體液免疫應答、導致p16抗體產生的真正原因，為進一步開發更靈敏的抗體檢測方法奠定了基礎。

綜上所述，p16、ANXA-1抗體在NSCLC中的表達變化提示其可能參與NSCLC發病機制。p16a抗體在NSCLC患者血漿過表達，且隨肺癌進展表達逐漸增強，提示p16a抗體對NSCLC早期診斷、分期預測有一定價值。此外，p16a抗體表達與病理類型、腫瘤的低分化、淋巴結轉移有關，提示p16a抗體或許與NSCLC預后有關，但仍需大規模回顧性研究進一步驗證。