IL-6/STAT3信號通路與肝癌研究進展①

柳輝 郭樂 丁淑琴 李元 姜中佳（寧夏醫科大學臨床醫學院，銀川750004）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟常見腫瘤，惡性程度較高，臨床治療難度大，且預后極差。全球每年約有80萬人罹患肝癌。我國每年新發肝癌病例約為35～40萬例，HCC死亡總人數占全球死亡病例50%以上［1］。肝癌發生發展是多基因調控及多因素相互作用的復雜過程。研究認為，“非可控性炎癥”是HCC的重要特征，持續或低強度的炎癥刺激可導致過量炎癥因子表達，引發原癌基因活化和抑癌基因失活，促進腫瘤發生發展。因此，深入研究炎癥因子在HCC發生發展中的功能及分子機制，同時抑制其在HCC中的過度表達，是基礎科研及臨床治療的重要目標。

1 肝癌組織中IL-6表達

IL-6可由單核細胞、T細胞、成纖維細胞和內皮細胞等多種細胞合成和分泌，是一種多效性細胞因子，在腫瘤微環境中含量豐富，對腫瘤發生發展具有潛在作用［2］。研究認為，IL-6高表達及異常信號通路與HCC患者免疫缺陷及預后密切相關。田愛平［3］發現，誘導性肝癌組織中IL-6表達水平顯著高于癌旁組織，通過質粒轉染過表達IL-6，腫瘤重量及體積明顯高于轉染空質粒載體的陰性對照組，同時細胞活力、增殖能力顯著增強。LIU等［4］研究發現，IL-6高表達可通過募集免疫抑制細胞，如髓系來源抑制細胞，在HCC微環境中誘導強免疫抑制。研究顯示，阻斷IL-6可顯著增強HCC抗腫瘤免疫作用。此外，徐倩［5］通過制備新型單克隆抗體HC6R1證實，阻斷IL-6可顯著抑制HCC細胞HepG2和Huh7增殖、遷移、黏附和侵襲。

2 IL-6/STAT3信號通路

IL-6受體系統由2種跨膜蛋白組成：一是負責信號轉導，相對分子質量為13 0000的非配基結合鏈糖蛋白130（gpl30，也稱CD130或IL-6R0）；另一部分是可與IL-6直接結合，相對分子質量為80 000的配基結合鏈IL-6Rα（又稱CD126或gp80）。其中IL-6Rα可分為膜結合型（membrane-bound IL-6R，mIL-6R）和可溶型（soluble IL-6R，sIL-6R）2種，研究認為mIL-6R是觸發IL-6信號傳導的最主要途徑。相應靶細胞表面，IL-6與mIL-6R首先結合，并誘導mIL-6R自身構型變化，繼而與gp130胞外端緊密結合，誘導mIL-6R/gp130蛋白復合物形成，促使gp130迅速發生同二聚化作用，激活信號，這種信號激活途徑即為經典信號傳導途徑（圖1A）［6］。mIL-6R僅表達于肝細胞和部分白細胞亞型，不表達mIL6-R的 細 胞 中，IL-6還 可 與sIL-6R結 合 激 活gp130，發揮生物學效應，這種信號轉導方式稱為反式信號途徑（圖1B）。近年研究發現，sIL6-R主要由mIL6-R胞外部分裂解產生，依賴于解聚素和金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM）基因家族成員的限制性蛋白水解作用及mRNA的選擇性剪接作用［7］。信號被激活后，二聚化gp130通過Janus激酶（Janus kinase，JAK）磷酸化進一步級聯誘導STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3形成二聚體，轉移至細胞核，激活調控基因轉錄活性，通過級聯信號傳遞發揮生物學效應。

圖1 IL-6參與腫瘤發生發展的機制Fig.1 Mechanism of IL-6 involved in tumorigenesis and development

大多數HCC患者體內IL-6/STAT3信號均異常激活，研究表明，幾乎所有IL-6家族的細胞因子均能激活STAT3蛋白，同時，STAT3也被認為是介導IL-6功能的最主要轉錄因子［8］。信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription proteins，STATs）在細胞信號傳遞方面具有重要作用，其家族成員分別為STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，其中STAT3在炎癥和腫瘤形成中具有重要作用。STAT3在肝癌細胞中異常激活，除影響腫瘤細胞增殖、轉化、侵襲、血管生成和凋亡等過程，還可通過調節腫瘤微環境促進腫瘤細胞糖酵解，同時降低其線粒體活性［9］。最近研究發現，IL-6/STAT3信號不僅對原發性肝癌有影響，其與繼發性肝癌形成也有密切聯系。其他部位腫瘤發生時，非惡性細胞釋放IL-6，激活肝細胞中STAT3信號，促進血清淀粉樣蛋白A1和A2（serum amyloid A，SAA）產生，通過形成促轉移生態位導致腫瘤轉移至肝臟，導致繼發性肝癌［10］。

3 IL-6/STAT3信號通路在肝癌發生發展中的作用機制

3.1 對肝癌細胞增殖能力的影響STAT3可能是抑制肝癌細胞過度增殖的重要靶點，活化的IL-6/STAT3信號可通過激活增殖相關因子轉錄活性，促進肝癌細胞增殖。體內實驗表明，肝癌組織中STAT3和p-STAT3蛋白表達明顯高于癌旁組織，同時其下游增殖相關因子cyclin D1和P21表達也顯著提高［11］。采用STAT3-siRNA體外轉染肝癌細胞株HepG2后發現其下游分子cyclin D1表達在不同時間點均顯著下調，同時細胞增殖實驗結果也發現，沉默STAT3表達，各檢測時間點細胞增殖率均明顯下調［11］。成纖維細胞生長因子19（fibroblast growth factor 19，FGF19）是成纖維細胞生長因子家族成員，通過與成纖維細胞生長因子受體（FGFR4）結合，參與HCC發生發展，在細胞增殖和分化中起重要作用。ZHOU等［12］在對小鼠HCC的研究中發現，IL-6/STAT3信號通路在促進FGF19驅動HCC發展中發揮鍵作用，阻斷IL-6/STAT3通路可抑制FGF19誘導的肝癌進展。組蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）在調節細胞周期中起重要作用，高表達HDAC3可通過STAT3途徑促進肝癌細胞增殖，沉默HDAC3可導致STAT3信號中斷，顯著抑制肝癌細胞增殖［13］。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）主要由胚胎期肝細胞分泌，成年后正常人體內幾乎檢測不到其表達，但約70%肝癌患者體內AFP含量顯著升高，因此AFP目前作為特異性肝癌標志物廣泛應用。AFP的生物學功能發揮可能部分通過持續激活STAT3完成。張澤亮等［14］研究發現，過表達AFP，STAT3蛋白磷酸化水平顯著上調，HepG2細胞增殖能力明顯提高，在細胞生長48 h后分析細胞周期發現，試驗組S期細胞明顯增多，提示AFP可能通過STAT3磷酸化信號促進肝癌細胞增殖。

3.2 對肝癌細胞遷移、侵襲的影響上皮間質轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是細胞通過失去極性，去分化為間充質表型，導致上皮細胞可塑性改變的生物學過程。目前普遍認為EMT廣泛參與肝纖維化和肝癌進程，與肝癌早期轉移密切相關。EMT發生時，分子水平表現為上皮細胞分子標志物E-cadherin表達降低，間質細胞分子標志物Vimentin表達增加。劉婷等［15］在HepG2和HCCLM3細胞研究中發現，體外單純添加IL-6可顯著提高p-STAT3水平，但無法直接誘導肝癌細胞EMT。IL-6和TGF-β共同刺激時，p-STAT3、p-Smad3、Snail、Vimentin表達水平比單獨刺激組顯著上調，相反E-cadherin表達明顯下調。提示IL-6/STAT3信號有望作為正向調節因子增強TGF-β1誘導的肝癌細胞EMT。

Twist是HCC進展中重要的EMT誘導劑，上調其表達可顯著抑制E-cadherin表達，誘導細胞轉移以提高腫瘤細胞惡性程度。ZHANG等［16］在人肝癌細胞株SMMC7721和MHCC97H研究中發現，過表達STAT3可顯著下調E-cadherin和β-cadherin表達，同時上調Vimentin表達，而敲除實驗則結果相反。進一步機制研究中，雙熒光素酶報告試驗結果顯示，STAT3可能通過結合Twist的啟動子增強Twist轉錄活性，促進肝癌細胞EMT。腫瘤組織中，異常的基質降解可導致腫瘤細胞無序生長，促發炎癥反應，并伴隨浸潤和轉移。基質金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）除可降解細胞外基質和基底膜外，還可促進腫瘤組織血管生成，與腫瘤細胞侵襲和轉移密切相關。祝普利等［17］研究人肝癌細胞株HepG2、HuH7、SMMC7721和MHCC97H時發現，STAT3特異性抑制劑JSI-124可顯著抑制肝癌細胞p-STAT3表達，同時降低肝癌細胞侵襲能力，且呈濃度依賴性，同時發現抑制STAT3表達可降低MMP-2和MMP-9蛋白表達及活性，且呈濃度依賴性。表明STAT3信號轉導通路在肝癌侵襲和轉移過程中起重要作用，其作用機制可能是通過調控下游MMPs表達參與肝癌發生發展。黃芩甙是從植物黃芩中提取、分離的黃酮類化合物，近年發現其具有顯著抗腫瘤作用。多項研究表明，其可明顯抑制肝 癌 細 胞 增 殖 和 轉 移［18］。LIU等［19］在HepG2和MHCC97H細胞系研究中發現，黃芩甙可通過重塑細胞骨架顯著降低肝癌細胞侵襲能力，這一過程可能通過下調STAT3信號實現。

3.3 對肝癌細胞凋亡的影響多項研究表明，HCC發生發展不僅是細胞增殖分化失控、轉移侵襲失調的結果，細胞異常凋亡也具有重要作用。在肝癌起始、促動、進展等各階段均伴有細胞凋亡，但其具體作用尚未闡明。IL-6是一種重要的抗腫瘤凋亡誘導劑。流式雙標記染色法檢測發現，將STAT3-siRNA轉入人正常肝細胞LO2和肝癌HepG2細胞株，24 h、48 h、72 h細胞凋亡率均顯著高于同時間點的空白對照組［19］。LIU等［20］研究人肝癌細胞系SNU-499發現，IL-6可通過活化STAT3信號提高阿霉素處理后的細胞生存率，同時降低細胞凋亡率。進一步研究表明，采用STAT3 siRNA或其小分子抑制劑LLL12阻斷IL-6/STAT3信號后，阿霉素處理后的肝癌細胞凋亡率明顯上調，提示靶向阻斷IL-6/STAT3信號通路可能通過促進肝癌細胞凋亡發揮抗腫瘤作用。藏紅花是鳶尾科番紅花屬的球根類花卉，作為藥物、香料或染料被廣泛應用，近年發現藏紅花素具有良好的抗癌活性，對前列腺癌、結腸癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤有潛在治療作用。KIM等［21］在HepG2和Hep3B細胞系研究中發現，藏紅花素可通過抑制IL-6誘導的STAT3活化導致STAT3去磷酸化，下調下游抗凋亡基因Bcl-2和survivin表達，促進肝癌細胞凋亡，同時下調特異性細胞周期蛋白cyclin D1表達，抑制肝癌細胞增殖。雷洛昔芬（Raloxifene）是一種選擇性雌激素受體調節劑，近年發現其對某些受體誘導的細胞凋亡具有抑制作用，有望用于肝癌治療［22］。WANG等［23］體內實驗發現，每日給予一定量雷洛昔芬可顯著抑制小鼠體內HepG2腫瘤生長，機制研究發現，雷洛昔芬對IL-6刺激的STAT3磷酸化具有抑制作用，通過抑制STAT3下游促凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl及survivin表達促進肝癌細胞凋亡。此外，WEN等［24］發現，阿帕替尼（Apatinib）可抑制人肝癌SMCC7721細胞系VEGFR2/STAT3信號活化，顯著下調VEGFR2和STAT3磷酸化水平，其下游BAX/Bcl-2比值升高，促進肝癌細胞凋亡，提示IL-6/STAT3信號通路可能通過Bcl家族影響細胞凋亡。細胞自噬是機體在應激條件下通過降解自身蛋白和衰老細胞器以適應外界環境變化的重要生理過程。自噬與肝癌細胞惡性生物學行為密切相關。LU等［25］研究 表明，人IL-6重 組蛋白可 誘 導HepG2細胞自噬，而沉默或采用單克隆抗體阻斷IL-6表達或活性后，自噬水平明顯降低。IL-6可能通過誘導自噬相關蛋白Beclin1、LC3B及NS5ATP9表達激活自噬過程。提示在肝癌發生發展中，自噬可能通過降解細胞衰老蛋白及細胞器為腫瘤細胞過度增殖提供物質保障，維持腫瘤細胞線粒體功能及能量平衡。

3.4 對血管生成的影響血管生成在腫瘤發展、轉移過程中起重要作用，抑制這一過程可明顯阻止腫瘤發展和擴散轉移。血管生成機制復雜，現已證實血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在腫瘤血管生成和腫瘤進展中扮演重要角色。VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有增加血管通透性、促進細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用，可通過與其受體VEGFR1和VEGFR2結合，迅速加快新生血管生長。盡管VEGF的誘導物種類豐富，但其啟動子的主要轉錄激活子僅有HIF-1（hypoxia inducible factor-1）和STAT3，提 示HIF-1和STAT3是VEGF表達的關鍵調節器［26-27］。WEN等［24］研究肝癌SMCC7721細胞系時發現，其VEGF和VEGFR2表達在mRNA水平和蛋白水平均明顯高于正常肝細胞。阿帕替尼是一種特異性VEGFR2抑制劑，可通過抑制p-STAT3和p-VEGFR2表達顯著下調肝癌細胞存活率，并上調其細胞凋亡率。特異性阻斷STAT3表達可進一步增強這一效應，提示STAT3在腫瘤細胞血管生成中具有重要作用。阿帕替尼可能通過下調p-STAT3和p-VEGFR2表達誘導其下游Bax/Bcl-2比值升高，進而促進細胞凋亡。田愛平［3］研究發現，小鼠慢性誘導性肝癌組織中IL-6、STAT3與VEGF、VEGFR2及CD31等相關血管內皮生長因子蛋白表達明顯高于癌旁組織，且表達水平呈正相關。而采用質粒轉染過表達IL-6，血管再生相關因子分子及蛋白水平表達也顯著提升，細胞增殖能力明顯增強，提示IL-6在肝癌患者腫瘤血管再生中具有重要調控作用。此外，XU等［27］證實STAT3是抑制腫瘤VEGF表達和血管生成的有效靶點，包括IL-6R、c-Src、her2/neu等多種誘導子激活的VEGF表達均在靶向阻斷STAT3信號的細胞中減弱。體外實驗結果顯示，采用小分子抑制劑靶向抑制STAT3將明顯下調HIF-1和VEGF表達，腫瘤細胞體內血管生成能力減弱，這一過程可能通過同時影響JAK/STAT和PI3K/AKT信號通路完成。證明STAT3可能是抑制腫瘤血管再生相關因子表達、影響血管生成的有效靶點。

4 針對IL-6/STAT3信號的肝癌靶向治療

HCC患者5年生存率僅為10%，其中手術患者的5年生存率可達40%～80%，但多數患者就診時已屬晚期，失去了手術機會［28］。因此，提高藥物治療的有效性是延長患者生存期限的關鍵。HCC發生發展因素復雜，涉及炎癥、死亡、新生血管及基因突變等多個領域，因此尋找潛在治療靶點是當前臨床研究熱點。

4.1 直接靶向IL-6/STAT3信號治療肝癌的策略

近年來，HCC治療藥物發展迅速，尤其是以免疫檢查點抑制劑為主的分子靶向藥物被先后用于臨床，療效和安全性等較好。但最近臨床試驗顯示，免疫檢查點抑制劑單藥對肝癌的治療效果有限，聯合用藥效果更佳。LIU等［4］研究IL-6在肝癌模型中的免疫調節作用，證實IL-6阻斷可增強HCC患者抗腫瘤免疫，與抗程序性死亡-1-配體1（PD-L1）檢查點抑制劑協同治療HCC可在一定程度上逆轉HCC對PD-L1抗體的耐藥性。高表達IL-6可通過上調抑制性免疫檢查點影響腫瘤浸潤性T細胞功能，表明靶向抑制IL-6可提高HCC抗PD-L1療效，為HCC分子靶向治療提供策略。徐倩［5］采用新型IL-6單克隆抗體HC6R1處理肝癌細胞系HepG2和Huh7發現，HC6R1可顯著抑制肝癌細胞增殖、遷移、黏附和侵襲，體內實驗結果表明，HC6R1可抑制小鼠腫瘤生長，并延長原位成瘤小鼠生存時間，其機制可能是通過抑制STAT3活化從而將細胞阻滯在G1/S期，抑制腫瘤細胞增殖的同時促進細胞凋亡。近年細胞膜受體gp130與腫瘤增殖、轉移和凋亡等的關系備受關注，湯嵩［29］研究發現，gp130在人肝癌細胞中呈高表達，采用具有口服活性的gp130小分子抑制劑SC144處理肝癌細胞株后，可有效促進肝癌細胞凋亡，并具有一定抑制腫瘤增殖作用。提示gp130可能是肝癌治療的另一重要靶點。當前，全細胞腫瘤疫苗已在癌癥防治中表現出巨大潛力，HAN等［30］研究肝癌細胞系H22和Hepa1-6時發現，STAT3阻斷全肝癌細胞裂解物可抑制腫瘤發生和生長，延長荷瘤小鼠存活時間，同時刺激免疫T細胞及NK細胞活化，增強CD8+T細胞在腫瘤組織中的浸潤，增強細胞毒性，此外，樹突狀細胞成熟度提高，促進肝癌免疫記憶產生，當免疫小鼠被HCC細胞攻擊時，隨T細胞和NK細胞激活和浸潤，可引發繼發性免疫反應。STAT3阻斷的全肝癌細胞裂解物可阻止HCC介導的T細胞和NK細胞衰竭，表明免疫小鼠T細胞和NK細胞上的PD-1和TIGIT等免疫檢查點分子呈低表達，表明STAT3阻斷的全細胞肝癌疫苗具有腫瘤細胞免疫的潛力。

4.2 針對miRNAs靶向IL-6/STAT3信號治療肝癌的策略miRNAs為非編碼小分子RNA，在血管生成、細胞增殖、存活和分化等多個生理過程中起重要作用［31］。研究認為，miRNAs在人類惡性腫瘤發展中作為腫瘤抑制因子發揮作用［32］。目前開發的藥物多數靶向單個位點，而miRNAs可靶向多個位點，因此其在肝癌治療方面具有巨大潛力。

HCC中miR-124表達顯著下調，過表達miR-124可促進HCC細胞凋亡并抑制其增殖。LU等［33］機制研究發現，miR-124可通過直接結合STAT3 3'UTR區抑制STAT3和p-STAT3蛋白表達，轉染miR-124的HepG2細胞中過表達STAT3可有效消除miR-124對細胞增殖抑制作用。提示miR-124可通過靶向STAT3發揮腫瘤抑制作用，有望成為肝癌診斷、治療的生物標志物。

miR-197也被認為是潛在的癌癥診斷分子標志物，其表達水平與HCC患者生存期呈顯著正相關。WANG等［34］采用體外合成的膽固醇修飾的miR-197類似物治療肝癌荷瘤小鼠，發現其可明顯抑制腫瘤生長，減小腫瘤體積，表明miR-197有望用于肝癌治療。肝癌組織芯片分析發現，miR-197與IL-6、STAT3蛋白水平呈負相關，體外實驗結果顯示，過表達miR-197在促進細胞凋亡的同時，可通過將細胞阻滯在G1期從而抑制其增殖，同時將miR-197及STAT3過表達載體轉入肝癌細胞將顯著逆轉這一現象，表明miR-197可能作為潛在的治療靶點干預IL-6/STAT3信號通路在肝癌發生發展中的作用［34］。

裸鼠肝癌模型研究發現，過表達miR-345對腫瘤生長及肺轉移具有抑制作用，進一步機制研究顯示，體外過表達miR-345可顯著抑制STAT3及AKT蛋白表達，同時E-cadherin蛋白表達明顯增高，Claudin-1、N-cadherin及Snail蛋白表達降低，提示EMT過程被抑制［35］。雷帕霉素作為STAT3通路阻斷劑，已被證明可有效抑制肝癌細胞侵襲和轉移。YU等［35］研究發現，雷帕霉素可降低EMT發生頻率，提示STAT3/AKT信號可能作為EMT上游因子發揮正向調節作用。表明miR-345可顯著調節腫瘤微環境，其機制可能是通過靶向STAT3/AKT信號抑制EMT，阻止肝癌細胞侵襲和轉移。

肝癌miRNAs表達譜中也發現miR-26表達下調［36］。多項研究表明，IL-6 3'UTR區同時具有miR-26a和miR-26b的結合位點［37-38］。體外實驗結果顯示，轉染miR-26b后HepG2細胞IL-6、p-STAT3蛋白表達被顯著抑制，同時自噬相關蛋白Beclin1表達下調，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上調，提示自噬發生，沉默IL-6表達，自噬水平上調［38］。證實miR-26b通過靶向抑制IL-6/STAT3信號通路激活誘導肝癌細胞自噬，為肝癌診治提供新的靶點。miR-26a也被證實與HCC轉移和復發呈負相關［36］。YANG等［36］研究發現，過表達miR-26a顯著抑制IL-6表達，同時STAT3下游靶基因，包括Bcl-2、Mcl-1、cyclin D1及MMP2表達明顯下調，提示細胞凋亡過程被促進而增殖過程被抑制，過表達IL-6可拮抗這一作用。提示IL-6是miR-26a調節HCC微環境的功能靶分子，miR-26a可通過抑制IL-6/STAT3信號通路發揮對HCC的抑制作用。臨床試驗結果表明，miR-26a和IL-6聯用對HCC預后的預測效果最好，優于miR-26a或IL-6獨立預測［36］。

此外，研究發現，與癌旁組織相比，miR-125b及miR-543在HCC中表達顯著降低，腫瘤組織中高表達miR-125b或miR-543的HCC患者術后生存率更高，腫瘤復發率更低［39-40］。靶向抑制miR-543表達可顯著提高肝癌細胞增殖率，同時降低其凋亡率，可能通過降低p-JAK2、p-STAT3、c-Myc和Bcl-2表達完成。IL-6R和STAT3 3'UTR區均具有miR-125b的結合位點［37］。JIA等［39］體外研究發現，過表達miR-125b可通過直接靶向調節IL-6R和Mcl-1抑制細胞增殖和細胞周期循環，提示miR-125b可能在HCC發生發展中發揮關鍵抑癌基因作用，進一步研究其功能可能為HCC治療提供新靶點。

5 結語

體內細胞因子網絡是一個復雜的體系，炎癥因子異常表達在HCC發生發展中扮演重要角色。IL-6、STAT3、p-STAT3異常表達可通過影響肝癌細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡和血管生成等方式促進腫瘤進展。采用IL-6單克隆抗體、gp130抑制劑、STAT3沉默及靶向miRNAs等方式阻斷該信號通路在抗肝癌治療中療效較好。未來對該方向的深入研究將有助于HCC的靶向治療研究，為新的靶向藥物研發，并通過靶向干預與其他藥物聯用改善臨床治療效果提供新的思路。