植物寄生線蟲對化感信號的識別及機制

李春杰 王從麗

（中國科學院東北地理與農業生態研究所 中國科學院大豆分子設計育種重點實驗室，哈爾濱 150081）

植物寄生線蟲病是導致農作物減產的重要病害之一，每年由于線蟲危害導致的損失超過1 500億美元［1］。植物寄生線蟲的二齡幼蟲在土壤中具有趨化性，通過識別由植物根部或者根際微生物釋放的化學物質定位寄主，然后侵染寄主。線蟲這種隨著化學信號物質濃度梯度而移動的現象叫做趨化性，趨化性長期以來被認為是線蟲定位寄主植物的主要原因。線蟲主要是利用其頭部或者尾部感應器官-化感器感應由根或根圍微生物產生的水溶性或氣體引誘劑，被吸引后移動到植物的根部，例如溫度、氧氣、二氧化碳、酸、堿、鹽、氨基酸等；同時也可感應不利環境所產生排斥、躲避或者逃避等一系列的應激行為［2-9］。線蟲到達寄主前是非取食階段，需要在能量消耗殆盡前找到寄主，如果能夠使線蟲尋找寄主并未侵染寄主前使其能量消耗殆盡，或干擾、消減吸引線蟲侵染的信號物質，使線蟲失去侵染寄生植物的機會，即線蟲到達寄主植物前由于信號物質的干擾而使線蟲侵染失敗，這樣不僅達到事半功倍高效防治線蟲的目的，而且由于侵染行為提前被終止，所以種植抗病和感病品種都不受影響，特別是抗病品種資源缺乏時，利用現有的感病品種將是最大的益處，因為一個抗性品種的培育需要多年。因此，鑒定植物寄生線蟲預侵染階段的天然調節化感物質或者相關調控的分子信號物質，對于開發新型殺線蟲劑具有重要的理論和應用意義。目前，有關模式線蟲秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的化感分子調控機制研究相對比較多，且在線蟲中有一定的保守性。但由于植物寄生線蟲獨特的侵染結構（口針）和寄生特征，使其與模式線蟲有一定的差異，進而加大研究困難，致使植物寄生線蟲化感方面的分子調控機制報道甚少。因此本文對當前植物寄生線蟲對環境信號的識別或趨化性研究進展進行了綜述，再以秀麗隱桿線蟲的化感機制為基礎，針對植物寄生線蟲的化感機制研究進展進行了總結和展望。

1 植物寄生線蟲趨化性的信號物質

植物寄生線蟲依靠化學信號定位寄主的觀點是Steiner在1925年提出的，隨后這一觀點在許多研究中得以證實［10-11］。通過體外趨化實驗已報道有很多吸引線蟲的引誘劑，例如，簡單的無機鹽Na+、Mg2+、Cl-和CH3COO-及環磷酸腺苷（cAMP）均能夠吸引腎線蟲（Rotylenchulus reniformis），而這些離子對爪哇根結線蟲（Meloidogyne javanica）卻不吸引［11］；萜烯類化學物質及離子能夠吸引柑橘線蟲（Tylenchulus semipenetrans）［12］；氨基丁酸和谷氨基酸吸引馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensis）和馬鈴薯白線蟲（G. pallida）［13］。漆永紅［14］報道Cl-和NO3-對馬鈴薯腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）有吸引作用，而SO42-和HPO4-有排斥作用，HCO3-和CO32-對線蟲沒有影響。CuSO4對甜菜孢囊線蟲（Heterodera schachtii）具有很強的吸引［15］。二氧化碳和氧氣被認為是長距離吸引線蟲到根圍的非特異性趨性物質［16］。

根際分離的灰霉菌和半裸鐮刀菌對D. destructor具有很強的吸引［17］，根際細菌及其放線菌的代謝產物對南方根結線蟲（M. incognita）也具有吸引作用［18-19］，淡紫擬青霉發酵濾液對大豆孢囊線蟲（H. glycines）具有趨避作用［20］。王雪等［21］報道感病大豆品種對H. glycines具有強烈的吸引性，而抗病品種對線蟲具有排斥性。Zhao等［22］發現，M. incognita被植物根的吸引和排斥存在著寄主特異性。根滲出物中鑒定出對線蟲有吸引和排斥的化學物質，如丁正蛟［23］從7種植物中鑒定出1-二十二烯對M. incognita有吸引作用；Xu等［5］從甘薯乳液中分離出的十八烷基香豆酸，對D. destructor有很強的排斥作用。線蟲卵孵化也會受到根分泌物的抑制［24］。

植物激素也參與調控線蟲的趨化性，激活的乙烯信號途徑能夠降低根結線蟲［25-26］和大豆孢囊線蟲［27］對寄主根的吸引，即乙烯信號途徑負調控線蟲的吸引；然而，激活的乙烯信號途徑卻提高了對甜菜孢囊線蟲的吸引［28］。Sikder和Vesterg?rd［29］詳細綜述了根特異性或非特異性代謝產物作為線蟲幼蟲的引誘劑、排斥劑或殺線蟲劑、卵孵化刺激劑或抑制劑對植物寄生線蟲的影響。性激素作為大豆孢囊線蟲的雄蟲引誘劑及馬鈴薯金線蟲同種線蟲之間的吸引也起著非常重要的作用［30-31］。

Hamada 等［32］提出了一個線蟲吸引模型，證實許多化感物質在不同階段參與了根對線蟲的吸引，主要參與3個階段。首先是種子黏液（mucilage）吸引線蟲運動到種子要發芽的根部位置，Tsai等［33］通過分析擬南芥黏液突變體發現根結線蟲對擬南芥種子的吸引需要種皮黏液的合成和擠壓，提取的黏液單獨不能明顯的吸引根結線蟲，但是種皮的碳水化合物和蛋白質是線蟲被吸引所必需的成分；該研究表明根結線蟲的趨化物質是在種皮黏液擠壓過程中新合成的，但可能高度不穩定；根結線蟲這種依賴于黏液的趨化機制能夠影響正在萌發的幼苗，但來自于幼苗根部的信號物質是獨立于黏液信號物質，而且幼苗根部信號很可能掩蓋黏液信號物質。根萌發后，第二組化合物引導線蟲運動到侵染位點。Oota等［34］通過篩選合成物質及分離鑒定根部多胺化合物對南方根結線蟲的趨化實驗，發現在兩個末端氨基間擁有3-5個亞甲基的多胺，例如尸胺、腐胺和丙二胺能吸引線蟲到達植物合適的侵染位點。到達根部后，第三組化合物如寄主修飾的線蟲信息素水平和種類可能控制侵染的水平［35］。例如目前研究的熱點——線蟲蛔甙（ascarosides）信息素ascr#18是由線蟲所分泌的攜帶親脂側鏈脂肪酸的雙脫氧蛔糖基的糖苷，不僅參與線蟲之間的化學通訊而產生線蟲的積聚，還能被寄主植物修飾轉化成短的側鏈蛔甙排斥線蟲，從而降低線蟲的侵染［35-36］。這和前人報道的基本相似，第一組化合物通常是揮發性氣體物質，進行長距離吸引線蟲到根圍，例如CO2、O2、萜烯類化合物、類黃酮、芳香醇等；第二組化合物通常是水溶性物質能夠短距離吸引線蟲到根尖部位，如酸性pH、堿性pH、鹽、激素、氨基酸等；第三組局部線蟲之間的化學通訊決定線蟲侵染水平（圖1）。這些研究表明線蟲趨化性和線蟲識別、定位和侵染寄主有著密切的關系。

圖1 植物寄生線蟲的趨化性和化感信號轉導途徑在防治上的應用Fig.1 Application of chemotaxis of plant-parasitic nematode and the transduction pathway of semiochemical signals in nematode control

2 根結線蟲和大豆孢囊線蟲的趨化性差異

由于根結線蟲（root-knot nematode，RKN）和孢囊線蟲（cyst nematode，CN）所引起的危害在植物寄生線蟲中達到80%，所以對這兩種線蟲的研究比較多。這兩種線蟲都是定居性內寄生線蟲，在植物根部存在時，卵孵化成二齡幼蟲（J2）識別根際釋放的信號尋找并定位寄主，但根結線蟲的廣寄主范圍與孢囊線蟲的相對窄寄主范圍說明孢囊線蟲對寄主識別的信號可能具有特異性，例如大豆孢囊線蟲（SCN）的寄主主要是大豆，而根結線蟲能夠侵染超過2 000種植物。Wang等［6］研究發現，無論是寄主（大豆和辣椒）還是非寄主（萬壽菊）的活體根尖，RKN均能被吸引，而SCN只能被大豆根吸引，說明大豆孢囊線蟲的寄主專化性；但是大豆、辣椒和萬壽菊根提取物和滲出物都吸引SCN，但排斥RKN；線蟲吸引和排斥的行為表明兩種線蟲識別的主要化學信號的差異，因為根提取物和根滲出物只包含水溶性化學物質，而活體根尖包含了揮發性的、水溶性和非水溶性的物質，所以不同的組織材料包含不同的化學物質導致吸引的差異，說明線蟲化感物質的復雜性。

識別的差異還表現在對寄主根的識別部位上，大多數RKN對寄主根的識別位于根尖的1.5 mm內［37］，而SCN則 位于根尖的5 mm內［29］，這 與其他報道一致：RKN主要被吸引到根尖的伸長區并在該處侵入［38］，SCN能夠侵入根尖更廣泛的部位［39］。這些差異可能與根際微環境酸性pH有關，因為利用pH指示劑表明，根尖伸長區的pH＜5，例如玉米［40-41］、番茄和模式豆科植物苜蓿（Medicago truncatula）［37］。試驗證明，根結線蟲被吸引的最佳pH范圍（4.5-5.5）低于大豆孢囊線蟲的pH范圍（5-5.5）（圖2），表明RKN對酸的忍耐范圍比SCN強［42-43］，間接的說明根尖不同部位對兩種線蟲的吸引差異的原因。Wang等［43］研究結果進一步證明，CO2吸引線蟲不是緣于CO2梯度，而是CO2改變了膠中的pH梯度。SCN在堿性條件下也有很強的吸引能力，而且有兩個pH吸引范圍：pH 8.4-8.8和pH 9.5-10，但RKN和SCN線蟲濃度一樣時，沒有明顯的吸引，在RKN線蟲高濃度時（10×）表現為與SCN相似的吸引范圍，但比較微弱（圖2）［42］。這些結果同樣說明，SCN對堿的敏感性比RKN強，RKN具有強的耐堿性。目前還不能解釋為什么會出現有兩個pH范圍，分子信號的挖掘可能會解釋這一現象。另外，其他線蟲諸如昆蟲病原線蟲對堿有兩個最適積聚濃度［44］，模式秀麗隱桿線蟲能夠被吸引的現象可達到pH=10，但當pH＞10.5時，產生強烈的排斥或者躲避［45］。這些結果表明，酸堿都影響線蟲的化感識別。

SCN和RKN對鹽的趨化性根據研究方法不同其結果有所差異（圖2）。Beeman 等［46］利用微流控芯片（microfluidic chips）方法研究表明：SCN的J2能夠被MgCl2、KNO3和NH4NO3吸引，但對KCl、Na2SO4或者ZnSO4沒反應。Hosoi 等［47］利用瓊脂塞（agar plug）做吸引實驗發現，0.5 mol/L KNO3和硝酸鹽類似物能夠吸引SCN。利用瓊脂膠吸引實驗表明，SCN被MgCl2吸引，但對Na2SO4和NaCl沒反應。Castro等［48］利用瓊脂膠介質發現，RKN對Cl-具有強烈的排斥反應。孟麗等［49］利用瓊脂糖平板培養基測試發現Cl-和SCN-鹽、Ba（NO3）2、NH4NO3、Mn（NO3）2、KH2PO4、K2HPO4、K2CO3、KOH、NaOH等對M. incognita均有排斥作用。Hua等［42］利用Pluronic膠系統［37］檢測發現，所有鹽（NaCl、KCl、KNO3、MgCl2、MgSO4和Na2SO4）都能夠吸引SCN，不同鹽的積聚模式不一樣，而且Na2SO4、KCl和MgSO4對SCN具有誘殺作用，即線蟲先被吸引過來，然后由于化學劑量效應使線蟲死亡，這對線蟲防治非常有意義。誘殺依賴劑量效應的現象在其它實驗中也得到證實，Wang 等［6］利用反相高壓液相色譜分離根系分泌物發現，極性小的組分對SCN具有很強的吸引作用，而且表現非常明顯的劑量誘殺現象，但對根結線蟲具有很強的排斥作用。這種依賴劑量的誘殺現象在SCN對不同氨基酸的趨化實驗中也被發現（未發表）。這些不同的現象說明線蟲對這些化感物質的識別是受很多因素影響，相應的感覺器官控制通路可能各異。

線蟲對這些化學物質趨避結果的差異可能與所檢測的線蟲種類、分離株系、所用植物組織材料或檢測的介質系統有關。Pluronic膠系統操作簡便、快捷、高效，可實時觀測到線蟲的運動軌跡，已成功觀察到了植物根部及其化學物質對線蟲的吸引以及線蟲的行為學，是目前研究線蟲趨化性和行為學的最佳介質［6，25，27，33，37，42-43，50-53］。利用這個系統結合鹽離子微電極檢測到SCN最佳趨化Cl-濃度范圍是171-256 mmol/L，低于這個范圍濃度沒反應，高于這個范圍濃度產生躲避反應。但RKN對2 mol/L NaCl的反應不同，M. hapla線蟲高濃度時才有趨化反應，低濃度無反應（圖2）；M. incognita無論高濃度還是低濃度對2 mol/L NaCl均無反應，這些再次說明RKN對鹽的耐性比SCN強。整體來說，RKN對于酸堿鹽的忍耐性遠遠大于SCN，也間接表明了根結線蟲的廣寄主性和大豆孢囊線蟲的窄寄主性不僅與寄主釋放的信號物質有關，可能還與環境化學信號有關。結合兩種線蟲對酸、堿和鹽的趨避特征，大豆孢囊線蟲對酸、堿和鹽的反應更為敏感，是用于研究對酸堿鹽趨避作用比較理想的典型植物寄生線蟲。

在趨化性研究中，一個普遍存在的現象是線蟲的積聚性，RKN線蟲積聚成球的現象非常普遍，但是不同RKN種和小種之間反應存在差異［37，53］。M. hapla對氰化鉀產生積聚性的基因被定位到線蟲的遺傳連鎖群L8上，這是第一個被標記的專性植物寄生線蟲的積聚基因［53］。對于大豆孢囊線蟲，Hua等［42］首次發現SCN能夠對 NaCl形成的濃度梯度在化學分配器外面聚成緊密的球狀，而對其它酸、堿或鹽的趨化性顯現為松散的聚集（圖2）。此外也觀察到兩種線蟲被吸引到根部和進入根部的時間也有差異，RKN到達根尖部一般會停留一段時間，不直接進入根部，而大豆孢囊線蟲到達根部直接侵染進入；在根暴露于線蟲24 h時特別明顯，例如，在同樣線蟲濃度的膠中，大豆根尖及其根圍沒有大豆孢囊線蟲聚集，但大豆根尖處有聚集成堆的根結線蟲，這種現象在其它作物-根結線蟲互作中普遍存在，這和前面講到根結線蟲比大豆孢囊線蟲更容易聚集成球一致。這種積聚成球或散狀的原因被認為是線蟲之間不同的通訊交流導致的，說明根結線蟲之間的通訊交流比大豆孢囊線蟲之間的通訊交流更為活躍。而形成這種通訊交流方式的原因之一可能是由于線蟲產生的蛔甙信息素產生的［35-36，54］，另外，神經元、分子信號受體和信號整合也是導致線蟲種群內部通訊行為的原因［55-57］。

圖2 大豆孢囊線蟲和北方根結線蟲的趨化性比較［42］Fig.2 Comparison of chemotaxis of H. glycines and M. hapla

3 植物寄生線蟲化感機制研究進展

線蟲對化學信號的趨避性、由濃度效應引起的誘殺現象及積聚模式都與線蟲的化感神經系統密切相關。目前對線蟲的化感系統研究比較清楚的是模式秀麗隱桿線蟲。秀麗隱桿線蟲作為模式線蟲的原因包括以下幾個特征：生活周期短（大約3-4 d），在培養基上容易培養，基因組小，且是世界上第一個被闡明所有體細胞（959個）發育譜系和神經元（302個）相互作用的多細胞生物，而且能夠遺傳轉化產生突變體。線蟲能夠檢測并響應多種感覺信號，如化感行為、滲透壓、觸覺、光敏感覺等，這些行為由不同的神經元所調控。化感神經元通常是通過感覺器的開口結構直接將感覺纖毛暴露到外界環境中，感知不同的化學信號進而產生趨避性或影響線蟲活力及休眠等。化感神經元具有雙邊對稱的特點，包括11對頭感器，2對尾感器及3對內陰唇神經元［58］。植物寄生線蟲的感覺神經器官與秀麗隱桿線蟲的感覺神經器官在結構上基本相似［59-60］。

在秀麗隱桿線蟲研究中發現，化感信號轉導依賴于G蛋白偶聯受體（G-protein Coupled Receptors，GPCRs）信號通路、由鳥苷酸環化酶（guanylate cyclase，GCY）（DAF-11和ODR-1）催化合成的第二信使cGMP信號通路，就是環狀核苷酸門控CNG通道（TAX-2和TAX-4），或由多不飽和脂肪酸PUFA介導的瞬時感受器電位TRPV通道（OSM-9和OCR-2）［58，61］（圖1）。秀麗隱桿線蟲基因組編碼大約1 000 個GPCRs，大多數是化感受體，如ODR-10作為氣味配體的受體；G蛋白在調控GPCR蛋白的下游中起著非常重要的作用，如類似Gi蛋白（Gi-like protein）的ODR-3作用于GPCR蛋白的下游調控嗅覺和傷害性受體；而G蛋白下游的tax-4/tax-2基因編碼的環狀核苷酸cGMP門控的離子通道或OSM-9/OCR-2組成的TRPV通道打開，使神經細胞去極化［58］。目前對線蟲的集聚行為研究最多和最清楚的是調控秀麗隱桿線蟲的取食行為的神經肽受體集聚基因NPR-1，而NPR-1基因是可表達的并與哺乳動物神經肽NPY受體相似的GPCR；NPR-1的內源性配體是FMRF酰胺多肽（FMRFamide like neuropeptides，FLPs）18和21，在不同的O2濃度下，通過感應神經表達的鳥苷酸環化酶GCY受體能調控線蟲的集聚及平衡線蟲的吸引和排斥［62-64］。

Yan和Davis［65］克隆了3個與秀麗隱桿線蟲同源的大豆孢囊線蟲gcy基因，這些基因定位在神經環、頭感器和尾部神經元里，但功能未知。模式秀麗隱桿線蟲能夠進行遺傳轉化來鑒定神經通路的功能，但植物寄生線蟲不能進行遺傳轉化，所以與模式線蟲相比，植物寄生線蟲在神經通路方面的知識非常有限。近些年發展的RNA干擾技術對于植物寄生線蟲的候選基因功能研究和驗證提供了強有力的反向遺傳學方法［66-67］。Dong等［68］發現，低劑量的月桂酸對RKN吸引，但高劑量對RKN具有誘殺作用，這與前面提到的鹽對SCN的誘殺是一致的。深入研究發現，這是受線蟲的flp18基因調控，但具體調控受體不清楚。近期我們研究團隊克隆了與秀麗隱桿線蟲同源的13個SCN-flp基因，并對其中flp1和flp11進行了功能研究，發現這兩個基因進行沉默后降低了SCN對植物的吸引，外源肽處理線蟲后flp1提高了SCN對植物的吸引（未發表）。植物寄生線蟲中存在同源的flp基因［69-72］，但對植物寄生線蟲flp基因的G蛋白偶聯受體研究甚少，而這些受體是研發新的殺線蟲劑的靶標位點。Kumari 等［72］根據水稻RKNM. graminicola轉錄組數據，克隆了9個flp基因和flp-18部分GPCR受體基因發現，RNA干擾影響了線蟲的侵入能力。神經肽樣蛋白NLP在植物寄生線蟲中也有報道，Warnock等［73］在M. incognita中鑒定了7個nlp基因，在馬鈴薯孢囊線蟲G. pallida中鑒定了4個nlp基因，其中應用外源肽處理線蟲發現能夠抑制線蟲的趨化性，NLP15b能夠抑制線蟲的趨化性，但對侵入沒有影響；進一步利用轉基因芽孢桿菌分泌大量的NLPs，能夠降低90%線蟲繁殖，說明這些神經肽是潛在的殺線蟲劑。有趣的是，這些神經肽對昆蟲病原線蟲Steinernema carpocapsae和C. elegans的吸引基本上沒有作用，可能原因是與植物寄生線蟲的同源比率較低，這個結果證明了這些肽對植物寄生線蟲的獨特性。Bresso 等［74］根據M. incognita基因組序列和GPCR包含有7個跨膜螺旋結構的特征，預測了117個候選GPCR，其中大多數是與線蟲化感系統和神經肽的GPCR有關，這些GPCR的鑒定及其未來功能的研究對于開發有效的殺線蟲劑提供了良好的開端。

Shivakumara等［52］在M. incognita中克隆了4個與秀麗隱桿線蟲同源的化感基因（odr-1，odr-3，tax-2和tax-4），odr-1與gcy基因同源，odr-3是G蛋白，包含Gα蛋白區域，tax-2/tax-4編碼cGMP離子通道，RNA干擾這些基因導致M. incognita線蟲的趨化性降低，而且也降低了對低劑量信息素asc#18的趨化性，對高劑量asc#18沒有影響，說明這些基因與寄主識別有關，信息素介導的信號受這些下調感應基因的影響。生物信息學分析表明，這些基因和根結線蟲親緣關系比較接近，但與孢囊線蟲關系相對比較遠，前面講到RKN和SCN對相同信號的不同反應可能解釋了這一現象。雖然感應受體或配體同源，但不同線蟲表現出遺傳和功能多樣性卻是非常普遍的現象［75］。

4 總結與展望

前面介紹了植物寄生線蟲對植物根部、代謝產物及化學物質的趨化反應，具體分為3個階段（長距離、短距離和局部）（圖1），特別是比較了大豆孢囊線蟲SCN和根結線蟲RKN對酸堿鹽氨基酸的趨化反應差異，并對植物寄生線蟲的化感機制進展進行總結。但相對于秀麗隱桿線蟲化感機制研究，植物寄生線蟲化感機制研究非常少，而且由于寄生方式的獨特性，雖然序列上有一定的保守，但功能上有差異，前面論述也表明了該觀點，因此分子機制有待深入研究，特別是信號轉導途徑需要更深入的研究。目前主要對環狀核苷酸門控CNG通道調控根結線蟲有初步研究，對瞬時感受器電位通道在植物寄生線蟲上仍屬空白。從應用角度（圖1），鑒定有效調控植物寄生線蟲趨化和排斥的天然調節劑，來控制線蟲對寄主的搜尋，或者發現興奮劑使線蟲興奮，在達到寄主前能量消耗殆盡而終止線蟲的定位和侵染；從線蟲化感信號途徑來講，GPCR受體及其通道基因的挖掘將是開發新一類殺線蟲劑潛在的靶標分子，通過RNAi干擾線蟲信號轉導途徑而影響線蟲的定位和侵染，從而在線蟲侵染早期就能達到防治目的。因此，深入探索線蟲與植物在預寄生階段的趨化特性和機制具有重要的應用價值和理論意義。