線蟲效應子MgMO237及互作蛋白OsCRRSP55在水稻中的共響應基因鑒定

李治文 劉培燕 陳建松，2 廖金鈴.2，3 林柏榮，2 卓侃，2

（1. 華南農業大學植物保護學院植物線蟲研究室，廣州 510642；2. 廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣州 510642；3. 廣東生態工程職業學院，廣州 510520）

擬禾本科根結線蟲（Meloidogynegraminicola）是水稻重要的病原之一，該線蟲引起的水稻根結線蟲病廣泛分布于熱帶和亞熱帶國家，包括中國、美國、孟加拉國、緬甸、老撾、印度、泰國、越南和菲律賓 等［1-2］。在我國，擬禾本科根結線蟲首先在海南省發現，其后在福建、廣東、廣西和安徽等多個省份均有報道，近年危害愈加嚴重［3-5］。該線蟲在水田通常可造成17%-32%的水稻產量損失，在旱地水稻田可造成更嚴重的危害，嚴重時導致高達80%的損失甚至水稻失收［6］。

近年來研究發現擬禾本科根結線蟲可分泌效應子至寄主植物中，這些效應子具有抑制植物防衛反應、改變植物信號通路等功能，有利于線蟲寄生。如Chen等［7］報道定位在線蟲亞腹食道腺的效應子MgGPP被線蟲分泌到寄主植物細胞質外體中，在效應子C端幫助下進入內質網，在內質網中N端發生糖基化且C端被水解，然后被運輸至細胞核中抑制植物防衛反應，促進線蟲寄生。另兩個效應子Mg16820和Mg01965同樣定位在線蟲亞腹食道腺并促進線蟲寄生。Mg16820在線蟲侵入水稻后的遷移階段被分泌到水稻細胞質外體，當線蟲進入固著性寄生階段時則被分泌到水稻細胞內，定位于細胞質和細胞核；Mg01965在線蟲遷移和固著寄生階段均被分泌到水稻細胞質外體［8-9］。其中Mg16820在植物細胞質外體和細胞內分別抑制病原相關分子模式促發的免疫反應（PAMP-triggered immunity，PTI）和效應子促發的免疫反應（effector-triggered immunity，ETI）［8］；而Mg01965在質外體時可抑制PTI，但在細胞內則無抑制植物免疫的作用［9］。進一步研究表明Mg16820與一個脫落酸響應基因蛋白：脫水應 激誘導蛋白（dehydration-stress inducible protein 1，DIP1）相互作用，推測其可能參與植物應激反應［8］。

本課題組前期構建了一個擬禾本科根結線蟲抑制差減文庫，從中克隆獲得MgMO237效應子，研究表明該效應子具有抑制植物PTI、促進線蟲寄生的功能。進一步研究發現MgMO237與3個水稻防衛相關蛋白相互作用，其中之一是水稻富含半胱氨酸重復序列分泌蛋白（Cys-rich repeat secretory proteins，CRRSPs）OsCRRSP55［10］。由于轉錄因子OsWRKY47能綁定OsCRRSP55啟動子區并啟動其轉錄，而WRKY家族基因通常受到水楊酸和茉莉酸調控，因此推測OsCRRSP55基因可能參與植物激素通路相關的防衛反應，MgMO237可能通過與OsCRRSP55互作干擾了植物激素信號通路，從而抑制植物防衛反應［10-14］。因此本研究進一步通過RT-qPCR技術檢測OsCRRSP55的表達特性，并通過RNA-seq（RNA sequencing）Illumina測 序 及RT-qPCR技 術 尋 找MgMO237與OsCRRSP55的植物激素通路共響應基因，為了解OsCRRSP55基因在線蟲寄生中的作用及尋找防控根結線蟲的靶標基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型日本晴水稻（Oryza sativacv. ‘Nipponbare’）、MgMO237轉基因水稻、pCAMBIA1305.1載 體、pUbi載體和經單卵囊純化后的擬禾本科根結線蟲種群均保存于華南農業大學植物線蟲研究室。

1.2 方法

1.2.1OsCRRSP55基因擴增及序列分析 用天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒提取水稻根總RNA。取2 μg RNA，用北京全式金生物技術有限公司反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，以該cDNA為模板，設計一對覆蓋基因開放閱讀框的引物（本研究所用引物見表1）擴增OsCRRSP55基因全長。PCR反應體系（50 μL）為：cDNA 1 μL，KOD FX 1 μL，2 × KOD FX Buffer 25 μL，dNTPs 10 μL，上下游引物各1.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應程序為：94℃預變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸1 min，30個循環；68℃延伸5 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物純化回收，連接到北京全式金生物技術有限公司的pEASY-Blunt Simple載體上，最后轉化克隆送廣州天一輝遠基因科技有限公司測序。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

通過NCBI進行OsCRRSP55同源序列檢索，使 用ClustalW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）和Boxshade（http：//sourceforge.net/projects/boxshade/）軟件進行序列比對及作圖。用SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分別預測信號肽序列和跨膜結構域。

1.2.2OsCRRSP55基因在水稻不同器官的表達分析 分別提取水稻種子及14日齡水稻根、莖、葉RNA并反轉錄獲得cDNA。以該cDNA為模板，用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）擴增OsCRRSP55基因和水稻內參基因OsUBQ（Os03g13170），檢測OsCRRSP55基因在水稻各器官的相對表達量。RTqPCR反 應 體 系（20 μL）為：2 ×GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL；上下游引物各0.4 μL；cDNA 1 μL；RNase-free Water 8.2 μL。擴增程序為：95℃預變性2 min；95℃變性10 s，60℃擴增30 s，40個循環。所有實驗取3次生物學重復處理的樣品，每個樣品設置3個技術重復，用2-ΔΔct方法計算基因的相對表達量。

1.2.3OsCRRSP55基因響應線蟲侵染的表達分析 將200條擬禾本科根結線蟲侵染前2齡幼蟲接種至14日齡水稻根部，7 d后分別取根結及健康水稻的相應根部位，提取RNA并反轉錄獲得cDNA。以該cDNA為模板，用RT-qPCR檢測OsCRRSP55基因的相對表達量。

1.2.4OsCRRSP55基因響應水楊酸和茉莉酸甲酯的表達分析 用8 mmol/L水楊酸（salicylic acid，SA）和100 μmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）水溶液（含0.02%（V/V）吐溫20）噴施14日齡水稻葉片，直至形成細密水膜。以含0.02%（V/V）吐溫20的清水為對照，置于28℃培養24 h［15-16］。提取上述水稻根部RNA并反轉錄獲得cDNA。以該cDNA為模板，用RT-qPCR檢測OsCRRSP55基因的相對表達量。

1.2.5 響應MgMO237的植物激素通路基因篩選與驗證 分別提取14日齡MgMO237轉基因水稻OE26、OE61株系和野生型水稻葉片RNA，反轉 錄 獲 得cDNA。以 該cDNA為 模 板，用RTqPCR擴增MgMO237基因和水稻內參基因OsUBQ（Os03g13170），檢測MgMO237基因的表達，確認陽性MgMO237轉基因水稻植株。

分別提取14日齡MgMO237轉基因水稻OE26、OE61和野生型水稻的根部總RNA，構建轉錄組文庫并用Illumina HiSeqTM 進行測序。通過 FDR（false discovery rate）與log2FC（FDR＜0.05且 |log2FC|＞1）篩選轉基因水稻和野生型水稻的差異表達基因。采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）法進行基因表達量計算。用EdgeR軟件進行基因表達差異分析，并對差異基因進行GO分析和KEGG分析。用RT-qPCR技術進行植物激素通路差異表達基因的驗證。

1.2.6 響應OsCRRSP55的植物激素通路基因分析 設計特異引物擴增帶有FLAG標簽的OsCRRSP55全長序列，將獲得的擴增片段和pUbi載體用NcoI和PmlI（賽默飛世爾科技公司）雙酶切，用東洋紡生物科技有限公司的Ligation High Ver.2連接酶連接獲得 pUbi∶OsCRRSP55∶FLAG瞬時表達載體。通過polyethylene glycol（PEG）介導原生質體轉化法將該載體轉化水稻原生質體［17］。基于Western blot技術，使用FLAG標簽抗體檢測OsCRRSP55蛋白的表達。水稻原生質體的制備、蛋白提取和Western blot分析按Chen等［10］描述的方法進行。提取過表達OsCRRSP55水稻和野生型水稻原生質體RNA并反轉錄獲得cDNA。以該cDNA為模板，用RTqPCR檢測響應OsCRRSP55的植物激素通路基因的表達量，獲得線蟲效應子MgMO237及互作蛋白OsCRRSP55在水稻中的共響應基因。

2 結果

2.1 水稻OsCRRSP55基因的序列分析

水稻OsCRRSP55基因cDNA編碼區全長798 bp，預測氨基酸長265 aa，蛋白分子量大小28.19 kD，具N端信號肽，不含跨膜結構域，含有兩個Unknown Function 26（DUF26）結構域，保守基序為C-X8-C-X2-C（圖1）。氨基酸序列相似性比對結果顯示，OsCRRSP55與多種植物CRRSP55氨基酸序列相似，其中與掃帚黍（Dichanthelium oligosanthes）的DoCRRSP55同源性最高，相似性為79.8%。

圖1 植物CRRSP55蛋白多序列比對和保守結構域分析Fig.1 Multiple sequence alignment and conserved motif analysis of plant CRRSP55 proteins

2.2 OsCRRSP55基因在水稻不同器官及響應線蟲侵染的表達分析

RT-qPCR檢測結果表明，OsCRRSP55在水稻的種子、14天齡的根、莖和葉中均有表達，其中在葉與根中表達量較高，分別為種子中表達量的24.35和5.39倍（圖2-A）。

與健康水稻根中的OsCRRSP55基因表達相比，擬禾本科根結線蟲侵染7 d后的根結中OsCRRSP55基因表達量顯著提高，提高約12倍（圖2-B）。

圖2 水稻OsCRRSP55基因的表達Fig. 2 Expression levels of OsCRRSP55 gene in rice

2.3 OsCRRSP55是水楊酸和茉莉酸響應基因

RT-qPCR檢測結果顯示，OsCRRSP55在外源水楊酸處理的水稻中轉錄水平顯著上調，其表達量是未經水楊酸處理水稻的2.52倍；結合OsCRRSP55基因啟動子區域的轉錄因子WRKY47表達水平也顯著上調，約為未經水楊酸處理水稻的7.73倍（圖3-A）。OsCRRSP55和WRKY47在茉莉酸甲酯處理的水稻中轉錄水平也顯著上調，與未經茉莉酸甲酯處理的水稻相比，分別上調1.97倍和2.45倍（圖3-B）。

圖3 水楊酸和茉莉酸甲酯處理水稻后OsCRRSP55和WRKY47基因的表達變化Fig. 3 Expression variations of OsCRRSP55 and WRKY47 genes in the rice treated with salicylic acid and methyl jasmonate

2.4 響應MgMO237的植物激素通路基因篩選與 驗證

RT-qPCR檢測結果顯示在野生型水稻中沒有檢測到MgMO237基因表達，而在兩個MgMO237轉基因水稻株系OE61和OE26中均能檢測到MgMO237基因表達（圖4），表明OE61和OE26為MgMO237轉基因水稻。

圖4 MgMO237轉基因水稻的鑒定Fig. 4 Identification of MgMO237-transgenic rice

對MgMO237轉 基 因 水 稻OE26、OE61株 系與野生型水稻進行轉錄組測序，利用EdgeR對轉錄組數據進行基因差異表達分析，統計結果顯示，OE26植株相對野生型植株有1 059個基因顯著上調，1 412個基因顯著下調。OE61植株相對野生型植株有740個基因顯著上調，2 290個基因顯著下調（圖5-A）。OE26和OE61植株相對野生型植株共同上調的基因有239個，共同下調的基因有782個（圖5-B），其中富集在植物激素信號轉導功能的基因共有10個，包括9個下調基因和1個上調基因。顯著下調的基因為IAA24（Os07g0182400）、IAA20（Os06g0166500）、IAA7（Os02g0228900）、PIL13（Os03g0782500）、b-ZIP TRANSCRIPTION FACTOR 62（Os07g0686100）、OsERF87（Os09g0572000）、CYCLIN-D3-1（Os09g0111100）、PR-1a（Os07g0129300）和PR-1b（Os01g0382000）；顯著上調的基因是TIFY11e（Os10g0391400），表明這些基因可能是MgMO237的植物激素通路響應基因。

圖5 MgMO237轉基因水稻與野生型水稻差異表達基因 統計Fig. 5 Statistics of differentially expressed genes between MgMO237-transgenic rice and wild-type rice

隨機選取5個上述植物激素信號通路差異表達基因，用RT-qPCR進行驗證，結果顯示MgMO237轉 基 因植株中的PR-1a、PR-1b、CYCLIN-D3-1和OsERF87基因發生明顯下調，TIFY11e基因發生顯著上調（圖6），與轉錄組測序的表達趨勢一致，表明轉錄組測序結果可靠。

圖6 RT-qPCR驗證MgMO237轉基因水稻與野生型水稻差異表達的植物激素通路基因Fig. 6 Confirmation of differentially expressed genes within plant hormone pathways in MgMO237-transgenic rice and wild-type rice by RT-qPCR

2.5 響應OsCRRSP55的植物激素通路基因分析

用FLAG標簽抗體檢測OsCRRSP55轉化水稻原生質體中的OsCRRSP55表達，Western blot結果顯示在OsCRRSP55轉化水稻原生質體蛋白中檢測到約28 kD特異條帶（圖7-A），條帶符合預期大小，表明OsCRRSP55蛋白瞬時表達成功。用RTqPCR技術對上述MgMO237的植物激素通路響應基因OsERF87、IAA24、PIL13、CYCLIN-D3-1、PR-1b和TIFY11e在OsCRRSP55轉化水稻原生質體中的表達進行分析，結果發現OsERF87基因表達顯著高于在野生型水稻原生質體中的表達，上調約3倍，其余基因均未發現顯著變化（圖7-B），表明OsERF87基因是MgMO237和OsCRRSP55的植物激素通路共響應基因。

圖7 OsCRRSP55影響水稻植物激素通路基因的表達Fig. 7 Expression levels of genes within rice hormone pathways responding to OsCRRSP55

3 討論

前期研究發現擬禾本科根結線蟲背食道腺表達效應子MgMO237在線蟲侵染7 d后表達顯著上調，與3個水稻蛋白：OsCRRSP55、OsGSC和OsBetvI相互作用，抑制水稻活性氧爆發、胼胝質積累和防衛基因表達，提高了水稻的感病性［10］，其中OsCRRSP55屬于DUF26蛋白超家族［18］。DUF26蛋白是有胚植物（embryophyte）特有的一類蛋白，根據蛋白含有的DUF26結構域數量、是否具信號肽、跨膜結構域和蛋白激酶結構域劃分為四類蛋白家族［18］。第一類是富含半胱氨酸類受體細胞質激酶（Cysteine-rich receptor-like cytoplasmic kinases，CRCKs），只含有兩個DUF26結構域，但沒有信號肽、跨膜結構域和蛋白激酶結構域；第二類是富含半胱氨酸類受體蛋白激酶（cysteine-rich receptor-like protein kinases，CRKs），具有兩個DUF26結構域及信號肽、跨膜結構域和蛋白激酶結構域；第三類是胞間連絲定位蛋白（plasmodesmata-localized proteins，PDLPs），具有兩個DUF26結構域及信號肽和跨膜結構域，但胞內缺少蛋白激酶結構域；第四類是CRRSPs蛋白，含有單個或多個DUF26結構域和信號肽，但不具有跨膜結構域和蛋白激酶結構域［18］。DUF26蛋白對植物的抗生物和非生物脅迫具有重要作用，包括干旱、高溫、鹽脅迫、真菌和細菌脅迫等［19］。例如水稻CRK10基因的激活表達能增強對白葉枯病的抗性［20］；擬南芥CRK家族基因，包括CRK4，CRK6和CRK36過表達均可增強擬南芥的免疫應答及對丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性［19-20］。DUF26還可結合糖，具有凝集素活性。如銀杏中純化出的CRRSPs蛋白Ginkbilobin2（Gnk2）含一個DUF26結構域，作為甘露糖結合的凝集素在體外發揮抗真菌作用［21-23］。玉米中兩種CRRSPs蛋白AFP1和AFP2可與甘露糖結合，參與對玉米黑粉菌的抗性［24］。然而，該超家族蛋白在植物與線蟲互作中的作用尚未見報道。本研究發現OsCRRSP55具信號肽和兩個DUF26結構域，但不含跨膜結構域和蛋白激酶結構域，屬于CRRSPs蛋白家族。RTqPCR結果顯示OsCRRSP55在水稻根中表達，且在根結線蟲侵染后表達量顯著升高，表明OsCRRSP55在線蟲寄生中發揮作用。

OsCRRSP55基因的啟動子具有OsWRKY47轉錄因子的結合區域［11］，之前研究發現水楊酸和茉莉酸可誘導一些WRKY轉錄因子表達［11-14］。本研究發現水楊酸和茉莉酸不僅顯著提高水稻OsWRKY47基因的表達，同時也顯著提高OsCRRSP55的表達，表明OsWRKY47和OsCRRSP55為水楊酸和茉莉酸響應基因。近年研究發現水楊酸和茉莉酸信號途徑在水稻抗擬禾本科根結線蟲中發揮作用，尤其是茉莉酸信號途徑［16］。因此我們推測MgMO237可能通過與OsCRRSP55的互作影響了寄主中水楊酸和茉莉酸等激素信號的傳遞，抑制了水稻的防衛反應，促進線蟲對水稻的寄生。為證明該推測，本研究進一步探索在水稻中是否存在MgMO237和OsCRRSP55的水楊酸和茉莉酸信號共響應基因。RNA-seq測序結果顯示與野生型水稻相比，包括OsERF87在內的9個植物激素通路相關基因在MgMO237轉基因水稻中轉錄下調，1個植物激素通路相關基因轉錄上調。同時RT-qPCR檢測發現在OsCRRSP55轉化水稻原生質體中，響應MgMO237的植物激素通路相關基因僅OsERF87基因顯著上調，其余基因表達沒有顯著變化，表明OsERF87受到OsCRRSP55和MgMO237的共調控。據報道，水稻OsERF87可被茉莉酸誘導表達，從而引起病程相關蛋白基因RSOsPR10顯著上調［25］。綜上，我們認為擬禾本科根結線侵染水稻后分泌效應子MgMO237，MgMO237通過與OsCRRSP55的互作抑制了茉莉酸響應基因OsERF87表達，從而影響了茉莉酸信號的傳遞，進而抑制了植物的防衛反應并降低了寄主對線蟲的抗性。

4 結論

水稻OsCRRSP55基因屬于DUF26蛋白超家族，能響應擬禾本科根結線蟲的侵染，同時能響應水楊酸和茉莉酸甲酯脅迫。線蟲效應子MgMO237與OsCRRSP55均能調控茉莉酸響應基因OsERF87的表達。前期研究已表明MgMO237與OsCRRSP55相互作用，且MgMO237可抑制植物免疫反應并增強植物感病性。綜上，推測MgMO237通過OsCRRSP55調控茉莉酸激素信號傳導，抑制植物防衛反應，促進線蟲寄生。