基于主客體作用的氟硼二吡咯超分子熒光調控及細胞成像應用

李星宇，曠桂超

（中南大學粉末冶金研究院，湖南長沙 410083）

超分子化合物是一類由非共價鍵作用力形成的復合物。由于非共價鍵作用具有動態(tài)可逆性，使得超分子化合物可以對外界刺激做出響應。BODIPY（氟硼二吡咯）作為一類傳統(tǒng)有機染料，具有許多優(yōu)異的光物理性質，如高熒光量子產(chǎn)率、高摩爾消光系數(shù)、穩(wěn)定的熒光發(fā)射等，并且由于其低細胞毒性與多位點易于修飾的特性，BODIPY 在細胞成像中也有十分廣闊的應用前景。

本文合成了一種8 位萘亞甲基吡啶鎓鹽修飾的BODIPY 衍生物（Naph-BDP）。通過主客體作用和靜電力作用，與葫蘆脲（CB）成功構筑了一種新型Naph-BDP/CB 超分子化合物，采用等溫滴定量熱、熒光光譜、核磁滴定、掃描電鏡等測試方法表征了超分子化合物的結果及光物理性質。結果表明，通過改變主客體之間的摩爾比，可以有效調控超分子化合物的熒光強度及聚集體形貌。進一步理論分析表明，在超分子化合物形成過程中，客體分子與主體分子存在的靜電作用及分子間電荷轉移是提高熒光發(fā)射的主要原因。最后，成功將該新型超分子化合物應用在細胞成像中。

1 實驗部分

1.1 藥品和儀器

2，4-二甲基吡咯，AR；三氟乙酸；三氟化硼乙醚溶液，AR；N，N-二異丙基乙胺，AR；4-吡啶甲醛，AR；2-溴甲基萘，AR，上述均為薩恩化學技術（上海）有限公司；葫蘆脲（CB），AR，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲苯，AR，國藥集團化學試劑有限公司。

RCT Basic 型磁力攪拌器，德高 IKA 集團；BUCHI R-210 型旋轉蒸發(fā)儀，瑞士 BUCHI 公司；CP124C 型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；Bruker Avance 400 Hz核磁共振波譜儀，德國 Bruker 公司；Nano SEM 230 型掃描電子顯微鏡，荷蘭Nova 公司；Hitachi U-5100型紫外可見光光度計，日本日立公司；Hitachi F-2700型熒光分光光度計，日本日立公司；FV1000 型共聚焦顯微鏡，Olympus 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 化合物Naph-BDP的制備（圖1）

圖1 化合物Naph-BDP的制備流程

化合物1: 根據(jù)文獻[9]合成了化合物1 并得到紅色晶體狀固體產(chǎn)物（產(chǎn)量177 mg，產(chǎn)率27%）。H NMR（CDCl）δ 8.78（dd，J = 4.4，1.5 Hz，2H），7.30（dd，J =4.3，1.6 Hz，2H），6.00（s，2H），2.55（s，6H），1.40（s，6H）。

化合物Naph-BDP：將化合物1（324 mg，1 mmol）與二溴甲基萘（343 mg，1.67 mmol）溶解于甲苯（200 mL）中。在N保護下，該混合溶液加熱至120℃并持續(xù)回流48 h。溶液冷卻后，將沉淀物過濾并將殘余物用甲苯（200 mL）洗滌。在40℃下真空干燥后，獲得紅色粉末狀固體產(chǎn)物（產(chǎn)量456 mg，產(chǎn)率86%）。H NMR（DMSO-d）. δ 9.45（d，J = 6.7 Hz，2H），8.50（d，J = 6.7 Hz，2H），8.02（d，J = 8.5 Hz，2H），7.97- 7.82（m，3H），7.65- 7.55（m，3H），6.28（s，2H），6.14（s，2H），2.47（s，6H），1.39（s，6H）.C NMR（DMSO-d），δ 156.9，151.3， 146.5， 142.4， 134.7， 132.9， 132.7， 132.0，129.1， 129.0， 128.8， 128.0， 128.0， 127.8， 127.2，127.1，125.3，122.5，63.8，40.1，40.0，39.9，39.8，39.7，39.6，39.4，39.2，39.1，14.8，14.4 ppm. ESI-MS m/z（CHBBrFN），calculated（M-Br）: 466.226 1，found:466.226 1。

1.2.2 化合物Naph-BDP與CB主客體實驗

取不同質量的CB溶解于相同濃度的Naph-BDP 的水溶液，形成一定比例梯度的Naph-BDP/CB 紫外熒光與一維核磁的待測液。

2 實驗方法

2.1 超分子化合物Naph-BDP/CB結構分析

如圖 2 所示，在 Naph-BDP 水溶液中，添加 CB 進行滴定實驗，可以計算出Naph-BDP/CB 的超分子復合物的摩爾比為2∶1，結合常數(shù)為4.3×10M。

圖2 Naph-BDP 與CB 等溫滴定量熱曲線（上）與TWO-SET模型擬合獲得熱力學參數(shù)（下）

為了探究Naph-BDP/CB 的超分子復合物結構，配制系列摩爾比的混合溶液進行一維核磁滴定（見圖3）。H NMR 滴定結果表明，在Naph-BDP 溶液中添加CB至其摩爾比為1∶0.25時，萘基和吡啶鎓鹽基團的上的質子信號會部分寬化并分裂。當Naph-BDP/CB 的摩爾比增加到1∶0.5時，這些信號峰會發(fā)生更大的移動甚至消失。但是，當加入更多的CB后，上述信號峰幾乎不再發(fā)生變化，表明該超分子復合物達到平衡，并進一步證明了Naph-BDP/CB主客體結構的結合比為2∶1。另外，e、f處的質子峰較大程度向高場位移，但氟硼二吡咯基團上的質子峰無明顯變化，可以證明當Naph-BDP/CB摩爾比為1∶0.5時，兩Naph-BDP分子會在CB空腔內(nèi)形成結構為萘基和吡啶鎓基團平行重疊的二聚體。

圖3 Naph-BDP與CB一維核磁滴定（上）與結構示意圖（下）

2.2 超分子化合物Naph-BDP/CB[8]熒光增強分析

配制CB/Naph-BDP 摩爾比分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%系列混合水溶液，并使Naph-BDP 濃度固定不變，在365 nm 波長下激發(fā)，得到一系列熒光發(fā)射圖譜（見圖4）。

圖4 水中不同摩爾比的復合CB/Naph-BDP的熒光光譜

從圖4可知，當CB摩爾比增加時，超分子化合物的熒光強度增強，并且當Naph-BDP/CB 摩爾比為1∶0.5時，熒光強度增強基本停止，這說明Naph-BDP/CB 的超分子復合物的摩爾比為2∶1，即一個CB 主體分子兩個Naph-BDP 客體分子相結合。由此可以推測，熒光增強的原因可能是靜電力與主客體雙重作用的結果。CB外圍的高電負性羰基會中和吡啶鎓鹽的電正性，從而減弱氟硼二吡咯基團到吡啶鎓鹽基團的電荷轉移，進而增強了氟硼二吡咯基團的本征發(fā)光，即圖4 中550～600 nm的熒光發(fā)射。另外，CB 環(huán)空腔剛好與雙萘基的尺寸匹配，有很強的主客體作用。

2.3 超分子化合物Naph-BDP/CB在細胞成像上的應用

分別使用含有Naph-BDP（5 μM）溶液以及Naph-BDP/CB 溶液（摩爾比為1∶0.5）將人直腸癌細胞SW480染色7 h，PBS洗滌細胞3次，同時使用商用染色劑ADPI進行示蹤，對細胞進行共聚焦成像，見圖5。

圖5 細胞成像（上）與熒光強度對比（下）

圖5 中，從（a）Naph-BDP（5 μM）和（e）Naph-BDP/CB（Naph-BDP 濃度為5 μM，CB濃度為2.5 μM）的共聚焦圖像可得，當細胞內(nèi)僅存在Naph-BDP 分子時，熒光強度較低，但此時向該細胞中加入CB時，熒光強度顯著增加，具有有效的細胞成像功能，這也與在熒光光譜中得到的數(shù)據(jù)一致。（b，f）為商用染色劑ADPI；（c，g）為明場圖像，（d，h）為疊加圖，可以發(fā)現(xiàn)該熒光超分子有較強的染色能力，同時說明超分子化合物Naph-BDP/CB 在細胞染色與示蹤上有一定的應用前景。

2.4 超分子化合物Naph-BDP/CB[8]微觀結構調控分析

配制一系列不同摩爾比的超分子化合物Naph-BDP/CB水溶液，噴金后進行掃描電鏡測試，見圖6。

圖6 Naph-BDP:CB 濃度比分別為（a，b，c）10 μM∶2.5 μM;（d，e，f）10 μM∶5 μM;（g，h，i）10 μM∶7.5 μM（j，k，l）10 μM∶10 μM的SEM圖像

從圖6 可以觀察到，當Naph-BDP/CB 摩爾比為1∶0.25 時，超分子化合物聚集成球狀，當摩爾比上升為1∶0.5 時，形態(tài)轉變?yōu)榧{米球狀。而當摩爾比繼續(xù)提高到1∶0.75 或1∶1 時，超分子結構由球狀變化為具有高度結晶性的塊狀晶體。根據(jù)上文的結構表征推測，當Naph-BDP 與CB 形成主客體超分子時，能顯著改善該復合物的水溶性，并且當摩爾比為1∶0.5 時，水溶性最佳。而當CB 摩爾比過高時，超分子化合物更多表現(xiàn)出結晶性，從而可以通過改變摩爾比來調控超分子化合物的形貌。

3 結論

（1）本文介紹了一種通過萘基溴化物和內(nèi)消旋-（4-吡啶基）-取代的BODIPY 之間的N-烷基化反應得到的BODIPY 衍生物分子Naph-BDP，并探究了其與CB結合形成超分子化合物的過程，證明了超分子結合摩爾比為2∶1，結合常數(shù)為4.3×10M。

（2）通過改變超分子化合物中主客體的相對含量，可以對其熒光強度及微觀結構進行調控，并成功應用在細胞成像中。