PTEN通過靶向P21誘導卵巢癌細胞衰老的機制研究①

柯小平 李 莉 李經維 劉 平 （同濟大學附屬楊浦醫院婦產科，上海200090）

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌［1-2］。卵巢惡性腫瘤中以上皮癌最多見，其次是惡性生殖細胞腫瘤。其中卵巢上皮癌死亡率占各類婦科腫瘤的首位，對女性生命造成嚴重威脅［3］。由于卵巢深居盆腔，體積小，缺乏典型癥狀，難以早期發現，卵巢上皮癌患者手術中發現腫瘤局限于卵巢的僅占不足30%，大多數已擴散到盆腹腔器官［4-5］，因此，早期診斷和特異性靶向治療是早期發現和治療的關鍵。PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10）是最早發現的具有磷酸酶活性的抑癌基因［6-7］，是 PI3K 通路的主要負調節因子［8］，在多種進展期和轉移性腫瘤中發生高頻缺失和突變，它通過使PIP3去磷酸化轉化為PIP2，下調細胞內PIP3的水平，拮抗PI3K的活性，負向調節AKT信號通路，使AKT 信號通路失活，進一步干擾眾多下游信號，從而調控腫瘤的增殖、遷移、侵襲［9］。PTEN 信號通路可通過誘導細胞凋亡、抑制細胞周期、抑制腫瘤細胞侵襲和轉移、抑制腫瘤血管形成、維持免疫系統的穩定性等發揮其抑癌作用［10］。除了經典的PTEN/PI3K/AKT 信號通路，PTEN 是否存在其他的調控卵巢癌發生發展的信號通路？目前大量研究發現，腫瘤與衰老存在密切聯系，大多數腫瘤發生在機體衰老時期，衰老細胞難以修復錯配基因，更易導致原癌基因的激活和抑癌基因的失活［11-13］，另一方面，衰老細胞的細胞周期發生阻滯，使細胞停留在G0/G1 期而抑制細胞增殖，從而阻止細胞過度增殖形成腫瘤。許多調控細胞周期的蛋白分子都參與腫瘤的發生，同時也參與細胞衰老的調控，如P53 和 P21 基因［14］。本研究發現，與正常卵巢組織相比，P21 蛋白在卵巢癌組織表達量較低，P21 表達減少會促進細胞增殖，使得細胞不易衰老，從而導致腫瘤的發生，因此，進一步研究了P21是否影響卵巢癌的發生發展，以及PTEN是否通過調控P21抑制卵巢癌細胞的增殖。研究結果顯示，PTEN 通過促進TRIM39 與P21 的結合，導致P21 不能被泛素化降解，間接地促進了P21 的表達，從而促進細胞衰老，抑制卵巢癌細胞的增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本收集及知情同意 收集2017 年1 月至2019 年12 月在同濟大學附屬楊浦醫院婦產科接受一期手術的30 例卵巢癌患者組織樣本和30例卵巢囊腫切除的卵巢樣本。納入標準：年齡35~65歲，近3個月未接受激素類藥物治療，排除術前接受化療的患者。本研究經同濟大學附屬楊浦醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署書面同意書，并告知患者組織只限用于科學研究。

1.1.2 試劑及設備 SKOV3 細胞購自上海中科院細胞庫；過表達PTEN及P21的慢病毒及干擾和過表達TRIM39 的慢病毒均購自上海吉凱基因化學技術公司；小鼠PTEN 抗體、小鼠P21 抗體、小鼠TRIM39抗體及兔Vimentin 抗體購自美國Abcam；對應二抗羊抗小鼠HRP 或羊抗兔HRP 購自美國CST；4%多聚甲醛、氯仿購自中國國藥集團；0.01 mo/l L PBS、抗原修復液、β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自中國碧云天公司；山羊抗兔555 二抗、DAPI 購自美國Ther?mo Scientific；Trizol 購自美國 Invitrogen；TB Green?Premix Ex Taq?試劑盒購自日本TaKaRa；PVDF膜購自美國Millipore；羊抗小鼠HRP 或羊抗兔HRP 購自美國CST；McCoY's 5A 細胞培養液購自美國Sigma；熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光染色 將卵巢癌組織樣本和正常卵巢組織樣本用眼科剪裁切成1 cm3大小的組織塊，浸泡在4℃4%多聚甲醛的組織固定液中72 h，液體石蠟包埋卵巢組織后行石蠟切片，室溫保存。行免疫熒光染色時，首先使用二甲苯對石蠟切片進行脫蠟，100%、90%、70%乙醇水化，然后放入盛有檸檬酸鈉抗原修復液的燒杯中，燒杯中的抗原修復液需漫過組織切片，95℃加熱15 min，自然冷卻至室溫后0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次。用含5%正常山羊血清的封閉液室溫孵育組織30 min，將小鼠PTEN抗體（1∶500）、小鼠P21 抗體（1∶500）、小鼠TRIM39抗體（1∶500）及兔Vimentin抗體（1∶500）稀釋于一抗稀釋液中，混勻，滴加在組織表面，4℃孵育過夜，0.01 mo/l L PBS 清洗，10 min×3 次后將山羊抗小鼠488二抗及山羊抗兔555二抗按照1∶1 000稀釋于二抗稀釋液中，混勻，滴加在組織或細胞表面，37℃室溫孵育 1 h，0.01 mo/l L PBS 清洗，10 min×3 次。在組織切片上滴加DAPI 染色液，蓋玻片封片，正置熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.2 細胞培養及病毒感染 McCoY's 5A 細胞培養液+10%胎牛血清作為完全培養液培養SKOV3細胞，當細胞融合密度達到90%時進行細胞傳代，按照試驗要求分別接種在6 cm 培養皿和24 孔板中，6 cm 培養皿用于檢測靶分子在mRNA 水平和蛋白水平的表達，24 孔板用于β-gal 和Tunel 染色檢測衰老細胞和凋亡細胞情況。過表達PTEN 及P21 的慢病毒滴度為 1×108TU/ml；干擾和過表達TRIM39 的慢病毒滴度均為 1×108TU/ml。SKOV3 細胞用 Mc?CoY's 5A 培養液調整密度為 5×106個/ml，接種于6 cm培養皿，待接種密度達到90%以上，加入400μl病毒感染增強液Hitrans GA 及100 μl 滴度為1×108TU/ml 的慢病毒或陰性對照（neg-control），37℃培養24 h，更換新鮮培養液繼續培養，隔天換液，感染后約72 h，觀察感染效率（GFP 陽性細胞數量），當效率達到或超過90%時，表示感染成功，可進行后續實驗操作。

1.2.3 Real-time PCR 樣本收集方法按照傳統RNA 抽提方式進行，細胞及血管組織中加入1 ml Trizol 后加入 200 μl 氯仿混勻后靜置 10 min，4℃12 000/r min 離心15 min，將上層的水相轉移至新的無 RNA 酶的 EP 管，加入 500 μl 異丙醇，混勻，靜置 10 min 后 12 000/r min 離心 10 min，棄上清，可見白色RNA 沉積于管底，75%乙醇清洗后晾干，待白色RNA 變為無色透明狀，加入30μl 焦碳酸二乙酯（diet-hylpyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA，儲存于?80℃。使用TB Green?Premix Ex Taq?試劑盒進行基因的定量PCR 檢測，采用20 μl 反應體系，95℃預變性 30 s 后 95℃ 5 s，60℃ 30 s 進行 40 個循環，反應結束后確認擴增曲線和融解曲線，依據公式2?ΔΔCT計算被檢測基因的相對量，然后進行組間比較。PTEN 引 物 序 列 ：forward：5'-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3'，reverse：5'-GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3'；P21 引 物 序 列 ：forward：5'-TGCAACTACTACAGAAACTGCTG-3'，reverse：5'-CAAAGTGGTCGGTAGCCACA-3'；TRIM39 引 物 序 列 ：forward：5'-GAAAGGGCGAGTTGACTCCAC-3'，reverse： 5'-GGCTGCATATTTGTCCCCATT-3'； GADPH引物序列：forward：5'-CTTGCTCAAGCTTAGTTCTAGG-3′，reverse：5'-GAGTGCTCAGTGGTATTGC-3'。

1.2.4 Western blot 體外培養細胞行蛋白抽提后首先進行BCA 蛋白定量測定蛋白濃度，在抽提的蛋白中加入相應體積的5×loading buffer，混勻后100℃蛋白變性5 min，分裝后置于?80℃保存。制備SDSPAGE，每孔上樣20 μg 總蛋白進行凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF 膜后，室溫封閉30 min，利用相應一抗：小鼠PTEN多克隆抗體、小鼠P21多克隆抗體、小鼠TRIM39多克隆抗體、兔GAPDH 多克隆抗體及對應二抗羊抗小鼠HRP 或羊抗兔HRP 檢測相應蛋白條帶，運用IPP軟件進行蛋白定量并比較組間差異。

1.2.5 β-gal 染色 使用β-半乳糖苷酶染色試劑盒對衰老細胞進行染色鑒定。β-半乳糖苷酶染色試劑盒以X-Gal 為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成深藍色產物，光學顯微鏡下很容易觀察到變成藍色的表達β-半乳糖苷酶的細胞。細胞使用β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10 min，0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次。然后加入β-半乳糖苷酶染色液A（10 μl）、β-半乳糖苷酶染色液B（10 μl）、β-半乳糖苷酶染色液 C（930 μl）和 X-gal（50μl）按照比例混合的染色工作液，37℃孵育4 h，普通光學顯微鏡下觀察、拍照、計數。如不能及時觀察拍照，可以去除染色工作液，加入相應體積的PBS，4℃環境下可以保存數日。每孔細胞選取10個視野拍照，計數10個視野β-半乳糖苷酶陽性染色細胞數目，除以總細胞數目，即為陽性細胞比例，對照各組間陽性染色比率，進行統計學比較。

1.2.6 Tunel染色 培養的細胞去除培養液后加入4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min。0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次。加入含 0.3% Triton X-100的 PBS，室溫孵育 5 min，0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次。按照TdT酶∶熒光標記液∶Tunel檢測液（1∶9∶10）的比例配置Tunel 染色液。每孔細胞中加入適當的Tunel 染色液，置于37℃避光孵育2 h，0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次后，用抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并計數Tunel 陽性染色細胞數，每孔細胞選取10 個視野拍照，計數10 個視野Tunel 陽性染色細胞數目，除以總細胞數目，即為陽性細胞比例，對照各組間陽性染色比率，進行統計學比較。

1.3 統計學分析 運用SPSS18.0軟件對所有數據進行分析。定量指標以表示，實驗數據采用單因素方差分析及Tukey's post-hoc 檢驗分析方法，P<0.05表示組間差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人卵巢癌組織與正常卵巢組織中PTEN 和P21表達比較 Real-time PCR 結果顯示，與正常人卵巢組織相比，人卵巢癌組織中PTEN 和P21 mRNA 表達水平顯著下調（圖1A）。Western blot結果顯示，與正常人卵巢組織相比，人卵巢癌組織中PTEN 和P21在蛋白水平表達均下調（圖1B）。免疫熒光染色顯示，與正常人卵巢組織相比，人卵巢癌組織中PTEN和P21 在蛋白水平表達均下調（圖1C）。依據上述研究結果，推測抑癌基因PTEN和衰老蛋白P21的表達下調與卵巢癌的發病具有相關性。

圖1 人卵巢癌組織與正常卵巢組織中PTEN 和P21 表達比較Fig.1 Comparison of expression of PTEN and P21 in human ovarian cancer tissue and normal ovarian tissue

2.2 P21 對人卵巢癌細胞衰老和增殖的影響 βgal 染色顯示，與正常卵巢癌細胞相比，過表達P21的SKOV3 細胞衰老細胞數目顯著增加（圖2A），Ki67 表達顯著降低（圖2B）。過表達P21 的SKOV3細胞中PTEN 在mRNA 及蛋白水平表達未有變化（圖2C）。

圖2 過表達P21對人卵巢癌細胞的影響Fig.2 Effect of overexpression of P21 on human ovarian cancer cells

2.3 PTEN 對人卵巢癌細胞衰老和增殖的影響 在SKOV3 細胞中過表達PTEN，促進了SKOV3 細胞的衰老（圖3A），抑制了SKOV3 細胞的增殖（圖3B）。過表達 PTEN 的 SKOV3 細胞中 P21 mRNA 和蛋白水平顯著升高（圖3C、D）。推測PTEN 通過促進P21 的表達促進卵巢癌細胞衰老，抑制卵巢癌細胞增殖。

圖3 過表達PTEN對人卵巢癌細胞的影響Fig.3 Effect of overexpression of PTEN on human ovari?an cancer cells

2.4 TRIM39 對人卵巢癌細胞衰老和增殖的影響 與正常卵巢組織相比，TRIM39 在卵巢癌組織中的mRNA 和蛋白表達顯著減少（圖4A~C）。在SKOV3 細胞中過表達 TRIM39，P21 mRNA 和蛋白水平顯著升高（圖4D）。結果顯示過表達TRIM39促進了SKOV3細胞的衰老（圖4E）。

圖4 過表達TRIM39對人卵巢癌細胞的影響Fig.4 Effect of overexpression of TRIM39 on human ovarian cancer cells

2.5 PTEN 對人卵巢癌細胞影響的機制驗證 在加入PTEN 激動劑naringin 的SKOV3 細胞中Realtime PCR 和 Western blot 結果顯示，PTEN 激動劑同樣促進了TRIM39 的表達（圖5A、B）。在干擾TRIM39 表達的SKOV3 細胞中加入PTEN 激動劑naringin，與對照組相比，P21 mRNA和蛋白表達顯著減少，衰老的卵巢癌細胞數量顯著減少（圖5C、D），說明PTEN 通過促進TRIM39 表達維持了P21 的穩定，減少了P21 的降解，從而促進了SKOV3 細胞衰老。

圖5 PTEN/ TRIM39/ P21 通路在人卵巢癌細胞衰老中的作用Fig.5 Role of PTEN/ TRIM39/ P21 pathway in senes?cence of human ovarian cancer cells

3 討論

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，其發病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌而列居第三位。其中上皮性腫瘤占原發性卵巢腫瘤的50%~70%，其惡性類型占卵巢惡性腫瘤的85%~90%［15-16］。手術和化療雖然可以治愈大多數初期患者，但卻不能挽救很多晚期患者的生命［17］。卵巢癌組織類型主要有交界性腫瘤、漿液性癌、內膜樣癌、透明細胞癌、黏液性癌。近10 年來，為了提高卵巢癌的治愈率，人們提出了新的分類方式，將卵巢癌分為Ⅰ型和Ⅱ型［18-19］。Ⅰ型為低級別腫瘤，包含BRAF、KRAS、PTEN 基因突變的內膜樣、黏液性、透明細胞癌。Ⅱ型腫瘤是高級別漿液性和癌肉瘤，包含 p53、BRCA1 和 BRCA2 基因突變［20-21］。基于卵巢癌多基因突變的原因，目前的治療方式除了傳統的化療藥物外，還包括靶向治療、抗血管生成治療和激素替代療法等。

抑癌基因PTEN（MMAJC1/TEP1）定位于染色體10q23.3 上，它的突變與缺失和人類多種腫瘤的發生有關。PTEN 基因主要通過其雙重底物特異性磷酸酶活性，經由P13K信號系統和MAPK信號級聯途徑發揮腫瘤抑制作用，對細胞生長、凋亡、增殖及黏附產生影響。近年來的研究成果已經證實，PTEN與子宮內膜癌、卵巢癌、宮頸癌等多種婦科腫瘤的發生發展密切相關［22-23］。然而，除了經典的PI3K/AKT 通路，PTEN 是否還通過其他途徑抑制卵巢癌的發生，有待于深入研究。本研究發現，人卵巢癌組織中PTEN、P21、TRIM39 表達顯著降低，P21 參與調控細胞周期，而TRIM39 則負責P21 的穩定。P21作為一種抑癌基因，隸屬于細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子，通過其編碼蛋白的水平來調控細胞周期，從而抑制腫瘤的發生發展。研究表明，P21 與腫瘤的增生、分化、轉移和浸潤程度相關，同時具有判斷預后的價值。與此同時，P21 也是一個調控細胞衰老的基因，其通過抑制細胞周期，促進細胞衰老［24-25］。因此，本研究觀察了P21 是否能夠促進卵巢癌細胞衰老，PTEN 是否能夠通過調控P21的表達抑制卵巢癌的發生發展。結果表明，P21 促進了卵巢癌細胞衰老，從而促使卵巢癌細胞周期停滯，抑制卵巢癌細胞增殖，這種作用可以通過調控PTEN的表達實現，表明PTEN能夠通過促進P21的表達抑制腫瘤的發生發展。然而，PTEN 并不能直接調控P21 的表達，因此，推測PTEN 可能通過調控P21 結合蛋白TRIM39，影響P21 的表達。研究結果顯示，PTEN 促進了TRIM39 的表達，從而促進了TRIM39與P21 的結合，阻止了P21 被泛素化降解，從而間接促進了P21的表達，促進了卵巢癌細胞的衰老。

TRIM39 自2000 年被克隆，其生物學功能仍不明確［26-27］。P21 是一個細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制分子，它通過調控細胞周期的進程，參與細胞生長、分化、衰老和死亡的調節，在細胞應對應激刺激以及腫瘤的發生發展中發揮重要的作用。研究發現TRIM39 與P21 相互作用，從而阻止CRL4Cdt2這個E3 復合物中的底物識別蛋白Cdt2 與P21 的結合，進而抑制CRL4Cdt2E3復合物介導的對P21的泛素化蛋白酶體降解，由此影響細胞周期以及細胞對DNA 損傷刺激的應答［28-29］。TRIM39 作為調控細胞周期的重要分子，在生理狀態下TRIM39與P21共同負向調控細胞周期進程，在DNA 損傷刺激條件下，TRIM39 對細胞周期停滯起至關重要的作用［30］。本研究發現PTEN 通過促進TRIM39 的表達從而阻止了P21 的降解，從而促使細胞周期停滯在G0/G1 期和細胞衰老，抑制了卵巢癌的發生發展。然而，PTEN 可能存在多種調控通路參與抑制腫瘤的發生，因此探索更多的調控腫瘤發生的下游靶基因，對于腫瘤的靶向治療具有重要意義。