基于多重生物信息學(xué)分析對膀胱癌關(guān)鍵基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究①

盧俅 陳兵海（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江212000）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，2018年全世界約有55萬新發(fā)病例，占所有惡性腫瘤的3.0%，發(fā)病率居惡性腫瘤第十位，全世界每年約有20萬人死于膀胱癌［1］。在我國，膀胱癌發(fā)病率位于全身惡性腫瘤的第十二位，每年約有8萬新診斷膀胱癌患者，約占全部惡性腫瘤的1.87%，死亡率位于惡性腫瘤的第十二位，約占所有惡性腫瘤死亡率的1.1%［2］。膀胱癌主要起源于上皮組織，約75%的膀胱癌屬于非肌層浸潤性膀胱癌，同時(shí)具有較高的復(fù)發(fā)率，患者預(yù)后較差［3-4］。目前膀胱癌的診斷主要依靠膀胱鏡檢查，膀胱鏡檢查雖然存在診斷陽性率較高的優(yōu)勢，但仍然有著巨大局限，如屬于有創(chuàng)檢查，存在一定的手術(shù)禁忌證等［5］。因此，目前迫切需要找到膀胱癌的新型分子標(biāo)志物，用于膀胱癌的診斷及預(yù)后判斷。基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）和癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是目前世界上最大的兩個(gè)癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫，近年來，已有眾多學(xué)者通過生物信息學(xué)的方法對這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫展開研究［6-7］。本研究立足于GEO和TCGA兩大數(shù)據(jù)庫，篩選差異交集基因集，利用多重生物信息學(xué)分析工具，發(fā)現(xiàn)CDC20、TPM1、ACTA2、MYH11、MYLK以及CALD1可能是膀胱癌關(guān)鍵的核心基因及治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 膀胱癌差異基因篩選從GEO數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載2個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)，分別為GSE13507和GSE7476。其中GSE13507的基因平臺是GPL6102 Illumina human-6 v2.0 expression beadchip，它包括188個(gè)膀胱癌組織和68個(gè)正常膀胱組織，GSE7476的基因平臺是GPL570 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，它包括9個(gè)癌組織和3個(gè)正常組織。為了進(jìn)一步利用不同數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證，又從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//tcga.xena?hubs.net/）下載膀胱癌的RNA-seq數(shù)據(jù)及相應(yīng)臨床隨訪數(shù)據(jù)。其中包括407個(gè)膀胱癌樣本，19個(gè)正常膀胱組織樣本。剔除臨床隨訪數(shù)據(jù)缺失的樣本，共獲得405個(gè)有完整臨床數(shù)據(jù)的膀胱癌樣本。利用SangerBox數(shù)據(jù)分析軟件中DECeter內(nèi)置limma包進(jìn)行差異基因的篩選，設(shè)置篩選條件：P<0.05，log2（FC）>1，得到3個(gè)差異基因集組成的數(shù)據(jù)集。利用SangerBox數(shù)據(jù)分析軟件中火山圖繪制工具繪制每個(gè)數(shù)據(jù)集的火山圖，采用維恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）獲得交集基因。

1.2 GO和KEGG通路富集分析使用Metascape在線分析網(wǎng)站（https：//metascape.org/）對301個(gè)差異基因進(jìn)行基因的本體論（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclo?pedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，設(shè)置P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interac?tions network，PPI）分析為了了解膀胱癌的新陳代謝和分子機(jī)制的重要途徑，將得到的301個(gè)差異基因集導(dǎo)入String在線分析網(wǎng)站（https：//string-db.org/）進(jìn)行PPI分析，為了獲得更直觀的可視化，將分析結(jié)果中TSV格式的文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，篩選出關(guān)鍵蛋白表達(dá)模塊與關(guān)鍵核心基因。

1.4 生存分析采用從TCGA下載的臨床數(shù)據(jù)及基因表達(dá)矩陣，對篩選獲得的核心基因，利用Graph?Pad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行生存分析，繪制K-M生存曲線（P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌差異基因篩選利用SangerBox數(shù)據(jù)分析軟件中DECeter內(nèi)置limma包，設(shè)置篩選條件：P<0.05，log2（FC）>1。在GSE13507基因芯片獲得在膀胱癌組織中75個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，424個(gè)表達(dá)下調(diào)基因，GSE7476中膀胱癌組織中得到584個(gè)上調(diào)基因，1 520個(gè)下調(diào)基因，TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得1 634個(gè)上調(diào)基因，2 671個(gè)下調(diào)基因。利用每個(gè)數(shù)據(jù)集的表達(dá)差異基因繪制火山圖及維恩圖（圖1）。

圖1 差異基因的火山圖和維恩圖Fig.1 Volcano Maps and Venn Diagram of differentially expressed genes

2.2 GO和KEGG通路富集分析使用Metascape在線分析網(wǎng)站進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示301個(gè)差異基因主要與含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、超分子纖維組織、肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)展、血管的發(fā)育、細(xì)胞基質(zhì)黏附、生長發(fā)育等功能相關(guān)，主要富集表達(dá)于黏著斑和Wnt信號等通路，富集結(jié)果以P值從小到大排列（表1、2）。

表1 前10的GO富集分析結(jié)果Tab.1 Top 10 GO enrichment analysis results

2.3 PPI和核心基因篩選將301個(gè)差異基因集導(dǎo)入String在線分析網(wǎng)站，為了獲得更直觀的可視化，再將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PPI關(guān)系中，上調(diào)基因（紅色標(biāo)記）和下調(diào)基因（藍(lán)色標(biāo)記）相互作用關(guān)系很少，為了更好獲得蛋白質(zhì)相互作用的核心基因，先是利用Cytoscape軟件的Mcode插件根據(jù)Degree得分篩選得到排名前六的蛋白質(zhì)表達(dá)模塊（圖3）。再分別對排名前二重點(diǎn)模塊進(jìn)行核心基因的篩選，得到2組核心基因（表3、4）。

表2 KEGG通路富集分析結(jié)果Tab.2 KEGG pathways enrichment analysis results

表3 前10蛋白表達(dá)模塊1的核心基因Tab.3 Top 10 hub genes of protein expression module 1

圖2 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Protein-protein interaction network

圖3 重點(diǎn)蛋白表達(dá)模塊Fig.3 Key protein expression modules

2.4 生存分析為了探究2.3獲得2組核心基因與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系，采用TCGA隨訪臨床數(shù)據(jù)及相應(yīng)基因表達(dá)量進(jìn)行生存分析，使用GraphPad Prism 8.0.1繪制K-M曲線，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDC20、TPM1、ACTA2、MYH11、MYLK以及CALD1與膀胱癌患者預(yù)后明顯相關(guān)（圖4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他核心基因差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膀胱癌組織中CDC20、TPM1、ACTA2、MYH11、MYLK及CALD1表達(dá)量越高，患者總生存期越短。

圖4 生存曲線Fig.4 Survival curves

2.5 核心基因?qū)Π螂装┲匾脑\斷價(jià)值為了探究與生存明顯相關(guān)的6個(gè)核心基因?qū)Π螂装┑脑\斷價(jià)值，利用TCGA數(shù)據(jù)庫基因的表達(dá)量對407例膀胱癌組織及19例正常膀胱組織進(jìn)行分析，受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線使用SPSS Statistics 22.0軟件繪制，結(jié)果提示：CDC20、TPM1、ACTA2、MYH11、MYLK以及CALD1對膀胱癌診斷的特異度和靈敏度均較高（圖5）。

圖5 ROC曲線分析顯示CDC20、TPM1、ACTA2、MYH11、MYLK和CALD1可能作為膀胱癌診斷的分子標(biāo)志物Fig.5 ROC curve analysis demonstrated that CDC20，TPM1，ACTA2，MYH11，MYLK，and CALD1 may be diagnostic biomarkers in patients with BC

表4 前8蛋白表達(dá)模塊2的核心基因Tab.4 Top 8 hub genes of protein expression module 2

3 討論

本研究立足于GEO和TCGA兩大數(shù)據(jù)庫，共獲得301個(gè)差異的交集基因。這些基因在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)的共有41個(gè)，下調(diào)的共有260個(gè)，隨后將301個(gè)差異基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因與整合素、細(xì)胞基質(zhì)的黏附相關(guān)。猜測在膀胱癌中整合素通過對細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展。在膀胱癌細(xì)胞中，MARTINO等［8］研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞基質(zhì)黏附的改變可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。通過KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)黏著斑信號通路可能與膀胱癌相關(guān)，已有研究證明FAK信號通路與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在結(jié)直腸癌中FAK信號通路的激活會加強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力［9］。國外眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)FAK途徑的激活可以促進(jìn)膀胱癌侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移［10］。通過對膀胱癌差異基因的GO和KEGG分析，猜測細(xì)胞基質(zhì)黏附的改變及FAK信號通路激活可能是膀胱癌進(jìn)展的潛在機(jī)制，可能為膀胱癌研究新型的治療方案提供參考。隨后將獲得的301個(gè)差異基因進(jìn)行PPI及生存分析，共得到6個(gè)與生存預(yù)后密切相關(guān)的核心基因。

在這些核心基因中，ACTA2的表達(dá)上調(diào)可以激活FAK信號通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［11］，CDC20、TPM1、MYH11、MYLK、CALD1與FAK信號通路在腫瘤中關(guān)系未見相關(guān)報(bào)道。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AC?TA2在膀胱癌組織中明顯下降（P=1.68E-13），且通過生存分析發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中ACTA2表達(dá)量與患者的預(yù)后密切相關(guān)（P=0.035）。本研究得出ACTA2在膀胱癌中具有一定特異性，推測ACTA2在膀胱癌中通過FAK信號通路發(fā)揮一定調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致膀胱癌進(jìn)展加快。GOULET等［12］研究發(fā)現(xiàn)ACTA2作為癌相關(guān)纖維母細(xì)胞的生物標(biāo)志物之一，其在膀胱癌中表達(dá)量增高，患者預(yù)后明顯變差，這與本研究結(jié)果相符。

CDC20是本課題組獲得的另外一個(gè)核心基因，全稱為細(xì)胞分裂周期20，是細(xì)胞分裂周期檢查點(diǎn)的重要調(diào)控分子，在細(xì)胞有絲分裂的后期發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其表達(dá)水平在惡性腦膠質(zhì)瘤、肺癌是明顯增多的［13-14］。CHOI等［15］研究發(fā)現(xiàn)，CDC20在膀胱癌組織中明顯高表達(dá)，CDC20表達(dá)水平與患者高齡、更高級別的病理分期、更高的臨床分期、近處轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)CDC20高表達(dá)的膀胱癌患者也預(yù)示著存在更短的無復(fù)發(fā)生存期（recur?rence-free survival，RFS）和總生存期（overall survival，OS）。本次研究發(fā)現(xiàn)，CDC20在膀胱癌組織中明顯高表達(dá)［log2（FC）=3.84，P=2.36E-29］，ROC曲線分析得出CDC20對膀胱癌診斷特異度和靈敏度特別高（特異度：0.947；靈敏度：0.779），生存分析發(fā)現(xiàn)膀胱患者CDC20表達(dá)量越高，患者總生存期越短，這與以往的研究結(jié)論相符。因此，認(rèn)為CDC20可能是膀胱癌的一個(gè)良好診斷和預(yù)后判定的分子。

本研究發(fā)現(xiàn)TPM1、ACTA2、MYH11、MYLK以及CALD1在膀胱癌組織中均明顯下降，為了進(jìn)一步研究這些基因在膀胱癌中發(fā)揮的作用，將以上基因?qū)隨tring在線分析網(wǎng)站。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因均富集在平滑肌收縮信號通路上（P=5.50E-14），我們猜測TPM1、ACTA2、MYH11、MYLK以及CALD1可能與血管平滑肌細(xì)胞的功能有關(guān)，通過影響細(xì)胞的黏附、遷移能力進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展。以TPM1為例，TPM1全稱是原肌球蛋白1，是原肌球蛋白家族的一員，該家族高度保守，主要參與橫紋肌、平滑肌的收縮系統(tǒng)及非肌肉細(xì)胞的骨架組成。近年來研究發(fā)現(xiàn)TPM1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［16-17］。WANG等［16］發(fā)現(xiàn)TPM1的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者的腫瘤大小、吸煙狀態(tài)、Fuhrman分級及預(yù) 后 相 關(guān)。LIN等［18］研 究 發(fā) 現(xiàn)TPM1通 過 調(diào) 節(jié)miR1835p.1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。LIU等［19］發(fā)現(xiàn)TPM1在膀胱癌組織中是低表達(dá)的，且可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，但TPM1影響膀胱癌機(jī)制還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，TPM1在膀胱癌組織中表達(dá)量明顯減少（P=3.07E-15），對膀胱癌診斷的靈敏度較高（靈敏度：0.914，AUC=0.857），生存分析發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者高表達(dá)的TPM1與較低總生存期呈正相關(guān)，GO富集分析發(fā)現(xiàn)TPM1與細(xì)胞基質(zhì)黏附相關(guān)，因此推測TPM1通過降低膀胱平滑肌細(xì)胞或癌細(xì)胞間黏附力，加速了膀胱癌細(xì)胞的惡化和遷移，進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展。此外，已有相關(guān)研究提示MYH11和MYLK可能是膀胱癌的生物標(biāo)志物［20-21］，但其調(diào)控膀胱癌機(jī)制目前尚不清楚。通過本次研究，猜測MYH11和MYLK可能是通過影響細(xì)胞的黏附、遷移能力進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展。CALD1全稱為鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，是茶堿家族的靶點(diǎn)，參與細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控，CALD1與CDC20的GO富集分析結(jié)果均與姐妹染色單體分離有關(guān)［22］。因此，研究結(jié)果顯示CALD1與CDC20可能通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)而發(fā)揮對膀胱癌的調(diào)控作用。

總之，立足于GEO和TCGA兩大數(shù)據(jù)庫，本次研究運(yùn)用多重生物信息學(xué)分析工具對膀胱癌進(jìn)行分析，從多個(gè)角度全面探討了膀胱癌中的關(guān)鍵基因及其相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDC20、TPM1、ACTA2、MYH11、MYLK和CALD1這6個(gè)核心基因?qū)Π螂装┰\斷的特異度和靈敏度均較高，可能是膀胱癌潛在的生物標(biāo)志物，當(dāng)然這些還需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)；膀胱癌中FAK信號通路激活、細(xì)胞的黏附、細(xì)胞周期的改變等可能是這些核心基因調(diào)控膀胱癌的分子機(jī)制，這為膀胱癌未來治療提供了新的思路。