青霉素對銀屑病模型小鼠腸道菌群變化及免疫功能調節作用的實驗研究①

金曌 王飛 蘇慧 張峻 殷翹（武漢市第一醫院皮膚科，武漢430022）

銀屑病是一種全身炎癥性疾病，由環境刺激引發皮膚細胞、免疫細胞和多種生物信號分子遺傳程序化的病理相互作用［1］。1型（Th1）和17型（Th17）T輔助細胞由皮膚中抗原呈遞細胞分泌的IL-12和IL-23激活，通過腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等多種細胞因子引發慢性炎癥，并改變皮膚表皮增生、分化、凋亡和新血管生成情況，從而導致銀屑病皮損［2］。研究顯示，微生物菌群改變可能導致免疫系統改變，從而誘發炎癥性疾?。?］。于堯等［4］發現，腸道菌群變化與皮膚炎癥存在相關性。王麗瑋等［5］研究指出，銀屑病患者存在腸道菌群改變，銀屑病發生與腸道菌群紊亂緊密相關。咪喹莫特是一種應用廣泛的銀屑病動物模型誘導劑，可激活免疫系統，誘導銀屑病皮損［6］。青霉素在感染性疾病治療中療效顯著，臨床研究顯示青霉素對銀屑病患者具有明確治療效果［7-8］。但青霉素對銀屑病作用的具體機制鮮有報道，故本研究以咪喹莫特誘導構建銀屑病小鼠模型，探討青霉素對銀屑病的可能作用機制，為闡明銀屑病發病機制及提出新的治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料24只4~6周齡雌性BALB/c小鼠，體重20~25 g，無菌飼養于特定溫度和濕度，剃光所有小鼠背部毛發，在醫院動物實驗中心飼喂標準飼料和水，標準飼料蛋白、碳水化合物和脂肪占熱量攝入量的20%、70%和10%。實驗按照《中國實驗動物護理和使用指南》進行，經我院動物倫理委員會批準。青霉素（華北制藥股份有限公司）；咪喹莫特軟膏（美國3M醫藥用品有限公司）；凡士林軟膏（廣州白云醫藥有限公司）；4%多聚甲醛（上海索寶生物科技有限公司）；蘇木精和伊紅染液（南京建成生物工程研究所）；ELISA試劑盒（美國cusabio公司）；糞便采樣盒（南京阿森泰科生物技術有限公司）；革蘭氏染色試劑盒（上海索寶生物科技有限公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物處理小鼠腹腔注射80 mg/kg戊巴比妥鈉，電動剃須刀剔除其背部毛發，露出面積約2 cm×3 cm，隨機分為青霉素組（備皮后外涂5%咪喹莫特軟膏8 d誘導銀屑病模型，腹腔注射0.1 ml青霉素，初始劑量20 mg/ml，100 mg/kg，連續7 d）、模型組（備皮后外涂5%咪喹莫特軟膏8 d誘導銀屑病模型，腹腔注射0.1 ml生理鹽水至實驗結束）和對照組（備皮后外涂凡士林軟膏8 d，腹腔注射等量生理鹽水至實驗結束），每組8只。

1.2.2 皮損嚴重程度評分第1、2、4、7天，采用皮損面積和嚴重程度指數（psoriasis area and severity index，PASI）評價小鼠背部皮損嚴重程度，紅斑、鱗片和浸潤情況評分，0分：無；1分：輕微；2分：中度；3分：嚴重；4分：非常嚴重。所有評分均由2名人員獨立進行評估，累積評分（紅斑+鱗屑+浸潤）反映炎癥嚴重程度（0~12級）［9］。

1.2.3 組織病理學染色實驗結束后處死小鼠，切除背部剃毛皮膚，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋24~36 h，切片（4μm），HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.2.4 血清免疫細胞因子水平檢測第7天采集3組小鼠血漿，室溫下10 000 r/min離心5 min，去上清，分離淋巴細胞，400 r/min離心20 min，收集第2層淋巴細胞，PBS稀釋，計數；每管加入2×106個細胞，加入熒光抗體冰上孵育20 min，PBS清洗2遍，離心，PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測血清CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD11c+樹突狀細胞（DCs）陽性細胞百分比（%）。

1.2.5 血清炎癥細胞因子水平檢測血清收集同1.2.4，采用ELISA試劑盒檢測血清IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23水平。

1.2.6 腸道菌群檢測第7天收集3組小鼠糞便，一部分用于乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及腸桿菌檢測，將稀釋后的標本接種至培養基進行培養，采用革蘭氏染色試劑盒進行菌種涂片染色鑒定，根據革蘭氏染色和細菌形態特征判斷目的菌：乳酸桿菌為革蘭氏陽性菌，多數菌種菌體較大，為直行或微彎行；雙歧桿菌為革蘭氏陽性菌，菌體長短、形態不一，多有分叉；腸球菌為革蘭氏陽性菌，菌種菌體為圓形或橢圓形；腸桿菌為革蘭氏陰性菌，中等大小，端圓，長短不一。計算菌落數，CFU/g=菌落數×稀釋濃度×100，結果以對數形式表示。剩余小鼠糞便標本用于微生物16s rRNA測序，由上海生工公司完成。

1.3 統計學處理采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，計量數據以±s表示，進行單因素方差檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組BALB/c小鼠皮損變化情況對照組小鼠背部皮膚無明顯變化；模型組小鼠第2天起背部皮膚出現紅斑、鱗片和浸潤，并逐漸明顯，第7天皮膚表現與人斑塊型銀屑病相似，病理可見皮膚明顯角化、棘突及炎癥細胞浸潤。青霉素組小鼠背部皮膚可見少量紅斑和薄鱗片，無明顯浸潤，皮膚病理變化明顯減輕。模型組小鼠第2、4、7天PASI評分明顯高于對照組（P<0.05），青霉素組第2、4、7天PASI評分明顯低于模型組（P<0.05，表1、圖1）。

圖1 各組小鼠第7天背部皮損情況、組織病理學染色情況及PASI評分（×400）Fig.1 Back skin lesions，histopathological staining at 7 d and PASI score of mice in each group（×400）

表1 各組小鼠PASI評分（±s，n=8，分）Tab.1 PASI score of mice in each group（±s，n=8，score）

表1 各組小鼠PASI評分（±s，n=8，分）Tab.1 PASI score of mice in each group（±s，n=8，score）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

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2.2 各組小鼠血清免疫細胞因子水平模型組小鼠CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比明顯低于對照組（P<0.05），CD11c+DCs百分比明顯高于對照組（P<0.05）；青霉素組CD4+T細胞百分比明顯高于模型組（P<0.05），CD11c+DCs百分比明顯低于模型組（P<0.05），CD8+T細胞百分比與模型組差異無統計學意義（P>0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠免疫細胞因子水平Fig.2 Immune cytokines levels of mice in each group

2.3 各組小鼠血清炎癥細胞因子水平模型組小鼠IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23水平明顯高于對照組（P<0.05）；青霉素組IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23水平明顯低于模型組（P<0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠血清炎癥細胞因子水平Fig.3 Serum inflammatory cytokines levels of mice in each group

2.4 各組小鼠腸道菌群數比較模型組小鼠乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及腸桿菌數與對照組差異無統計學意義（P>0.05）；青霉素組乳酸桿菌、雙歧桿菌數明顯少于模型組（P<0.05），腸球菌、腸桿菌數明顯多于模型組（P<0.05，圖4）。

圖4 各組小鼠腸道菌群數Fig.4 Intestinal flora quantity of mice in each group

2.5 各組小鼠腸道菌群OTU數及多樣性比較模型組小鼠OTU、Chao1、ACE、Shannon及Simpson值與對照組差異無統計學意義（P>0.05）；青霉素組OTU、Chao1、ACE、Shannon值明顯低于模型組（P<0.05），Simpson值明顯高于模型組（P<0.05，表2）。

表2 各組小鼠腸道菌群OTU數及多樣性比較（±s，n=8）Tab.2 OTU number and diversity of intestinal flora of mice in each group（±s，n=8）

表2 各組小鼠腸道菌群OTU數及多樣性比較（±s，n=8）Tab.2 OTU number and diversity of intestinal flora of mice in each group（±s，n=8）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

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2.6 各組小鼠腸道菌群門水平相對豐度比較模型組小鼠放線菌門、厚壁菌門、變形菌門及擬桿菌門比例與對照組差異無統計學意義（P>0.05）；青霉素組放線菌門、變形菌門比例明顯高于模型組（P<0.05），厚壁菌門、擬桿菌門比例明顯低于模型組（P<0.05，表3、圖5）。

圖5 各組BALB/c小鼠腸道菌群門水平相對豐度Fig.5 Relative abundance of intestinal flora phylum level of BALB/c mice in each group

表3 各組小鼠腸道菌群門水平相對豐度比較（±s，n=8，%）Tab.3 Comparison of relative abundance of intestinal flora phylum level of mice in each group（±s，n=8，%）

表3 各組小鼠腸道菌群門水平相對豐度比較（±s，n=8，%）Tab.3 Comparison of relative abundance of intestinal flora phylum level of mice in each group（±s，n=8，%）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

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2.7 各組小鼠腸道菌群細菌屬比例比較模型組與對照組小鼠副擬桿菌屬、糞芽孢菌屬相比差異無統計學意義（P>0.05）；青霉素組副擬桿菌屬、糞芽孢菌屬比例明顯高于模型組（P<0.05，圖6）。

圖6 各組小鼠腸道菌群細菌屬比例Fig.6 Proportions of intestinal flora bacterial genera of mice in each group

3 討論

銀屑病是一種病因不明的慢性炎癥性皮膚病，其發病是遺傳、環境和免疫學因素共同作用的結果［10］。最新研究表明，免疫細胞（尤其是T細胞、DCs）與角質形成細胞在推動炎癥過程中起重要作用，且這些炎癥過程參與銀屑病發展［11］。目前研究發現，T細胞在人銀屑病皮損過程中明顯增多［12］。T細胞激活的細胞因子信號通路是銀屑病炎癥反應的重要組成部分［13］。IL-23/IL-17軸失調參與以及其他炎癥細胞因子（如IL-1、IL-36和IL-22）過量產生在人類銀屑病發病途徑中發揮關鍵作用［14］。既往研究表明，長時間（5~7 d）采用TLR7激動劑咪喹莫特可誘發銀屑病樣皮膚炎癥［15-16］。研究顯示，咪喹莫特誘導的銀屑病樣炎癥明顯可反映人類斑塊型銀屑病特點，包括皮膚紅斑和鱗屑形成、表皮增厚、角質形成細胞分化改變、新血管生成和免疫細胞皮膚浸潤［17］。本研究采用咪喹莫特成功誘導銀屑病小鼠模型。

青霉素是治療感染性疾病的抗生素，研究證明，青霉素可用于銀屑病治療，且患者耐受性良好［18-20］。但青霉素對銀屑病的治療作用機制尚未闡明。本研究采用青霉素局部治療，可明顯減輕咪喹莫特誘導的BALB/c小鼠炎癥反應，顯著降低PASI評分，表明青霉素治療銀屑病可能通過減輕炎癥反應發揮作用。銀屑病是一種由T細胞介導的慢性炎癥性免疫性皮膚病［21］。本研究顯示，與對照組相比，模型組CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比明顯低于對照組，CD11c+DCs百分比明顯高于對照組，與模型組相比，青霉素組CD4+T細胞百分比明顯高于模型組，CD11c+DCs百分比明顯低于模型組，表明青霉素可能通過調節CD4+T細胞及CD11c+DCs調節銀屑病樣小鼠免疫功能。雖然CD8+T細胞是銀屑病的重要參與者，但本研究中CD8+T細胞百分比無明顯變化，可能與小鼠銀屑病致病機理與人銀屑病致病機理不同有關。

近年研究指出，微生物群在多種生物過程中發揮重要作用，其受環境和飲食因素影響，可維持效應T細胞和調節性T細胞平衡以及誘導免疫球蛋白A釋放，從而調節免疫應答［22］。此外，微生物群除對胃腸道有影響，還可影響其他器官和組織，腸道菌群失調在部分情況下與皮膚慢性炎癥性疾?。ㄈ玢y屑?。┯嘘P［23］?？股刂委熆稍诙虝r間內改變腸道菌群組成，降低其腸道菌群多樣性［24］。本研究發現，模型組和對照組腸道菌群數無明顯差異，而青霉素組乳酸桿菌、雙歧桿菌數明顯少于模型組，腸球菌、腸桿菌數明顯多于模型組，表明青霉素可改變銀屑病小鼠腸道菌群組成，增強其免疫功能。OTU代表物種豐富度，Chao1、ACE均代表物種總數，Shannon、Simpson代表菌群多樣性，Shannon越高，Simpson越低，菌群多樣性越高。進一步測序結果顯示，青霉素組OTU、Chao1、ACE、Shannon值明顯低于模型組，Simpson值明顯高于模型組，且青霉素組放線菌門、變形菌門比例明顯高于模型組，厚壁菌門、擬桿菌門比例明顯低于模型組，另外，副擬桿菌屬、糞芽孢菌屬比例明顯高于模型組，表明腹腔注射青霉素治療，銀屑病小鼠腸道菌群明顯改變，生物多樣性明顯降低。HUANG等［25］研究指出，阿奇霉素可通過減少溶酶體酸化及破壞TLR成熟和信號轉導抑制咪喹莫特誘導的DCs激活，并對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣炎癥具有明顯改善作用，可能是治療銀屑病的潛在藥物。另一項研究指出，IL-17抑制劑和IL-12/23抑制劑可改善銀屑病患者腸道微生物群組成［26］。因此，青霉素可能通過降低生物多樣性調節腸道免疫，從而改善免疫耐受與炎癥平衡，最終促進疾病轉歸，但尚缺乏更多證據支持，尤其是青霉素的用藥方式是否影響其對腸道菌群的作用有待進一步研究，后續還需進行更多體內外實驗驗證，為探索青霉素治療銀屑病的可能分子機制提供更多有價值的參考。

綜上所述，青霉素可通過改變腸道菌群組成降低腸道微生物多樣性，調節免疫細胞因子及相關因子表達，減輕銀屑病小鼠皮膚炎癥，從而改善皮損狀況，有助于進一步闡明銀屑病發病機理，為銀屑病治療提供新參考。